一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法技术

一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，其特征在于包括猪支原体肺炎抗原制备，冻干保护剂配制，抗原与保护剂的配比与混合分装，大规格疫苗的冻干组成，最后制成猪肺炎支原体活疫苗。该大规格生产方法，能在每个西林瓶(体积为7mL或10mL)中装50或100头份大规格容量，同时最优化每头份抗原效价能达到≥10

【技术实现步骤摘要】
一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法
本专利技术涉及兽用生物制品
，涉及一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法。
技术介绍
猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。近年来，猪支原体肺炎活疫苗应用逐步重视和广泛应用，传统生产10头份、20头份装量产品在免疫使用过程中存在频繁稀释操作的步骤。南京天邦生物科技有限公司申请的专利技术：一种猪支原体肺炎活疫苗50头份产品快速冻干方法，申请号201711096020.3，只报道了50头份的冻干方法，但是没有50头份及以上100头份的大规格整体生产方法的报道。因此，应对规模化养殖场使用大规格猪支原体肺炎活疫苗的需求，迫切需要大规格50头份、100头份的大规格整体生产方法，同时使产品质量高度稳定，抗原含量达到国家标准100倍以上。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，能在每个西林瓶(体积为7mL或10mL)中装50或100头份大规格容量，且每头份抗原效价能达到≥108CCU(国家标准100倍以上)，同时安全性好、制备方法简单、成本降低。技术方案：一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，包括猪支原体肺炎抗原制备，冻干保护剂配制，抗原与保护剂的配比与混合分装，大规格疫苗的冻干组成，最后制成猪肺炎支原体活疫苗。上述猪支原体肺炎抗原的制备方法为：1)生产一级种子液制备：从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌种，在无菌操作间，无菌打开，用pH值为7.4-7.6的KM2液体培养基原体积溶解冻干菌种，并按照质量比1:10继代于KM2液体培养基中，放入37℃恒温培养箱48-72小时，待培养物颜色略微变黄，pH值为6.2-6.8时，收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子液；2)重复步骤1)，分别扩大培养制备二级种子液和三级种子液；3)将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中，培养基体积为20L，培养基初始pH值调为7.6，37℃培养，转速设定为100r/min，培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次，pH值为6.2-6.8时，到达要求后收获，经纯粹检验及无菌检验合格后，准备再次放大；4)将30L种子罐内的培养物按照质量比5％-10％接种到300L培养罐内的KM2液体培养基中，培养基体积为200L，培养基初始pH值为7.6，37℃静置培养24h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化，24h后按照搅拌速度100-150r/min，工作罐压维持在0.06-0.08MPa，通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持在饱和浓度的30％-60％，补充NaOH碱液以维持pH值的稳定在7.2，并在补充葡萄糖维持1000mg/L，培养24h后，每间隔8h，取样进行CCU测定，绘制培养物的生长曲线；5)测定培养物在发酵罐培养64-72h时滴度达到109CCU/mL，收获培养物。上述冻干保护剂含有明胶和蔗糖，其余为蒸馏水，其中明胶含量为1.5wt.％～10wt.％，蔗糖含量百分比12.5wt.％～25wt.％。优选的，上述明胶含量为3wt.％或6wt.％，蔗糖含量为25wt.％。优选的，上述抗原与冻干保护剂在37℃温室下混合，其抗原与冻干保护剂的体积比为5:5、6:4、7:3、8:2或9:1。优选的，上述抗原与冻干保护剂分装在7mL或10mL西林瓶中，装量体积分别为2mL、3mL或4mL。上述冻干技术为先进行-40℃预冻3h～4h，一期升华-40℃～-15℃，18h～28h，干燥-15℃～28℃，14h～17h；或者，-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，14h～18h，干燥-15℃～28℃，6h～14h；程序控温设定：-50℃30min；-8℃15h；13℃1h10min；28℃6h50min，最后启动压塞，进行冻干疫苗的压塞、出箱有益效果：1、本专利技术的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，采用发酵罐培养方式，大批次培养的抗原量比传统转瓶培养效价更高，生产出的50、100头份成品的抗原含量达到国家标准100倍以上。2、本专利技术的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，50、100头份在7mL或10mL西林瓶上实现了装量4mL即可达到现行版《中国兽药典》对于猪支原体肺炎活疫苗的质量要求。最终，本专利技术的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法具有大产能是传统方式100倍，抗原含量标准又能达到传统方式的100倍，均一性和稳定性，能适应规模化生产的需要。具体实施方式下面结合具体实施例进一步描述本专利技术。这些实施例仅是举例说明，不应被视为对专利技术总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本专利技术的精神和范围下对本专利技术技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本专利技术的保护范围内。本专利技术实施例中用于猪支原体肺炎活疫苗(168株)为例说明本专利技术。本专利技术中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。实施例1猪支原体肺炎活疫苗(168株)抗原制备1.材料1.1毒株：猪支原体肺炎活疫苗(168株)由贵州福斯特生物科技有限公司提供。1.2材料：KM2培养基及相关实验耗材由贵州福斯特生物科技有限公司提供，细菌发酵罐生产车间由湖北大学生命科学学院提供。2.方法将猪支原体肺炎活疫苗(168株)按照程序一级种子液、二级种子液、三级种子液、30L种子罐、300L培养罐的培养方式，进行分步放大发酵培养，最后设定培养罐的培养条件的优化设计按照单个变量顺次进行，共进行了个参数的优化，根据发酵结束时支原体滴度的变色单位(ColourChangeUnit，CCU)结果判定优化效果。CCU含量测定方法操作如下：将猪肺炎支原体待测培养物用KM2培养基进行10倍连续稀释，即1.8mLKM2培养基接种0.2mL样品，依次1：10递减连续稀释成10-1、10-2……10-8、10-9、10-10、10-11、10-12，另设KM2培养基对照3管，共15管，同批作3个重复，置37℃培养，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化直至第10日，并对培养物涂片，染色，镜检，检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。稀释培养后，菌体生长、变色的最高稀释度为待检培养物CCU含量。2.1种子罐的培养步骤：1)生产一级种子液制备：从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌种，在无菌操作间，无菌打开，用KM2液体培养基(pH值为7.4-7.6)原体积溶解冻干菌种，并按照1:10继代于KM2液体培养基中，放入37℃恒温培养箱48-72小时，待培养物颜色略微变黄，pH值为6.2-6.8时，收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子液。2)重复步骤1)，分别扩大培养制备二级种子液、三级种子液。3)将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中，培养基体积为20L，培养基初始pH值调为7.6，37℃培养，转速设定为100r/min，培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次，pH值为6.2-6.8时，到达要求后收获，经纯粹检验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，其特征在于包括猪支原体肺炎抗原制备，冻干保护剂配制，抗原与保护剂的配比与混合分装，大规格疫苗的冻干组成，最后制成猪肺炎支原体活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，其特征在于包括猪支原体肺炎抗原制备，冻干保护剂配制，抗原与保护剂的配比与混合分装，大规格疫苗的冻干组成，最后制成猪肺炎支原体活疫苗。2.根据权利要求1所述一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，其特征在于所述猪支原体肺炎抗原的制备方法为：1）生产一级种子液制备：从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗（168株）菌种，在无菌操作间，无菌打开，用pH值为7.4-7.6的KM2液体培养基原体积溶解冻干菌种，并按照质量比1:10继代于KM2液体培养基中，放入37℃恒温培养箱48-72小时，待培养物颜色略微变黄，pH值为6.2-6.8时，收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子液；2）重复步骤1），分别扩大培养制备二级种子液和三级种子液；3）将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中，培养基体积为20L，培养基初始pH值调为7.6，37℃培养，转速设定为100r/min，培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次，pH值为6.2-6.8时，到达要求后收获，经纯粹检验及无菌检验合格后，准备再次放大；4）将30L种子罐内的培养物按照质量比5%-10%接种到300L培养罐内的KM2液体培养基中，培养基体积为200L，培养基初始pH值为7.6，37℃静置培养24h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化，24h后按照搅拌速度100-150r/min，工作罐压维持在0.06-0.08MPa，通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱燕锋，卢业云，杨德明，
申请(专利权)人：南京大爻网络科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32