修饰的纳米孔,包含其的组合物及其应用制造技术

本文提供涉及修饰或突变形式的溶细胞素A(ClyA)及包含其的组合物。特别地，修饰或突变形式的ClyA允许在低或生理离子强度下通过修饰的或突变的ClyA纳米孔对带负电荷的靶分子或聚合物有效捕获和/或转移。因此，还提供了使用修饰或突变形式的ClyA和组合物，例如表征带负电荷的靶分析物，例如靶多核苷酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的纳米孔，包含其的组合物及其应用相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月8日根据35U.S.C.§119(e)提交的美国临时申请号62/264,709的权益，其内容通过全文引用的方式并入本文。
本文提供了修饰的或突变形式的溶细胞素A(ClyA)以及包含其的组合物。还提供了使用所述修饰的或突变形式的ClyA和所述组合物例如表征目标分析物如目标多核苷酸的方法。
技术介绍
跨膜孔(如纳米孔)已被用于识别小分子或折叠蛋白，并监测单分子水平的化学或酶反应。DNA穿过重组在人工膜中的纳米孔的电泳移位在实际应用如DNA测序和生物标记识别中前景广阔。然而，双链或单链DNA穿过具有朝向内表面的带负电荷的氨基酸的纳米孔的移位是无效的。具体而言，在具有负内表面电荷和与溶液的德拜长度相当的半径的纳米孔中，由内部纳米孔壁上的双电荷层(EDL)产生的表面电势重叠，导致对于DNA进入纳米孔的大的静电能垒。因此，只能高离子强度溶液中或在不对称盐浓度下使用大纳米孔(例如10nm)或使用小纳米孔(例如～3.5nm)才能观察到DNA穿过这种纳米孔的移位。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于意外的发现，即虽然某些蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰的ClyA纳米孔，包含顺式开口，中间部分和反式开口，其中所述顺式开口的内表面包含第一带正电荷的氨基酸取代；所述中间部分的内表面包含第二带正电荷的氨基酸取代；并且所述反式开口包含带负电荷的收缩部。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.08 US 62/264,7091.一种修饰的ClyA纳米孔，包含顺式开口，中间部分和反式开口，其中所述顺式开口的内表面包含第一带正电荷的氨基酸取代；所述中间部分的内表面包含第二带正电荷的氨基酸取代；并且所述反式开口包含带负电荷的收缩部。2.根据权利要求1所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述第一带正电荷的氨基酸取代位于所述顺式开口内，以允许将脱氧核糖核酸捕获进所述修饰的ClyA纳米孔中。3.根据权利要求2所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述第二带正电荷的氨基酸取代位于所述中间部分内，以允许所述脱氧核糖核酸移位穿过所述修饰的ClyA纳米孔。4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述第一和第二带正电荷的氨基酸取代各自包含精氨酸。5.根据权利要求1-4中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述第一带正电荷的氨基酸取代对应于ClyA-AS的氨基酸序列中的S110R突变。6.根据权利要求1-5中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述第二带正电荷的氨基酸取代对应于ClyA-AS的氨基酸序列中的D64R突变。7.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔，其中所述修饰的ClyA孔是十二聚体孔。8.一种组合物，包含权利要求1-7中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔。9.根据权利要求8所述的组合物，还包含人造膜，其中所述修饰的ClyA纳米孔存在于所述人造膜中。10.根据权利要求8或9的组合物，还包含低离子强度溶液。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述低离子强度溶液是离子强度为约50mM至约1M的盐溶液。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述离子强度为约150mM。13.根据权利要求11或12所述的组合物，其中所述盐溶液包含氯化钠(NaCl)。14.一种使DNA移位穿过ClyA纳米孔的方法，包括：a.在低离子强度溶液中提供权利要求1-13中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔，和人造膜，其中所述修饰的ClyA纳米孔存在于所述人造膜中，使得所述修饰的ClyA纳米孔的顺式开口存在于所述低离子强度溶液的顺式侧并且所述修饰的ClyA的反式开口存在于所述低离子强度溶液的反式侧；b.在所述低离子强度溶液的顺式侧提供DNA；和c.跨所述修饰的ClyA纳米孔施加电势，从而使DNA从所述顺式侧移位穿过所述修饰的ClyA纳米孔到所述反式侧。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述低离子强度溶液是离子强度为约150mM至约300mM的盐溶液。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述离子强度为约150mM。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述盐溶液包含氯化钠(NaCl)。18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述DNA是单链DNA。19.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述DNA是双链DNA。20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述方法是用于DNA测序。21.一种修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽，包含与SEQIDNO：1(对应于野生型ClyA的氨基酸序列)或SEQIDNO：2(对应于ClyA-AS的氨基酸序列)所示的氨基酸序列至少95％同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含在SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的106-78范围内的位置处的第一带正电荷的氨基酸取代，和在SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的41-74范围内的位置处的第二带正电荷的氨基酸取代。22.根据权利要求21的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽，其中SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的位置1-32处的氨基酸产生净负电荷。23.根据权利要求21或22所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽，其中所述第一带正电荷的氨基酸取代位于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的位置110处。24.根据权利要求21-23中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽，其中所述第二带正电荷的氨基酸取代位于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的位置64处。25.根据权利要求21-24中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽，其中所述第一和第二带正电荷的氨基酸取代各自独立地包括精氨酸，组氨酸或赖氨酸。26.一种多核苷酸，包含编码权利要求21-25中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽的核苷酸序列。27.一种同源多聚体修饰的ClyA纳米孔，包含多个权利要求21-25中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽。28.根据权利要求27所述的同源多聚体修饰的ClyA纳米孔，包含12-14个所述修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽。29.根据权利要求27或28所述的同源多聚体修饰的ClyA纳米孔，其中所述修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽的所述第一带正电荷的氨基酸取代位于所述同源多聚体修饰的ClyA纳米孔的第一开口内，以允许捕获溶液内暴露于所述第一开口的带负电荷的聚合物。30.根据权利要求29所述的同源多聚体修饰的ClyA纳米孔，其中所述修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽的所述第二带正电荷的氨基酸取代位于所述同源多聚体修饰的ClyA纳米孔的中间部分内，以允许所述带负电荷的聚合物移位穿过所述纳米孔。31.一种异源多聚体修饰的ClyA纳米孔，包含至少一个权利要求21-25中任一项所述的修饰的ClyA纳米孔亚单位多肽。32.根据权利要求31所述的异源多聚体修饰的ClyA...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔瓦尼·马利亚，洛伦佐·弗兰切斯基尼，蒂内·邦斯，安德鲁·约翰·赫伦，拉科马·尼尚萨·贾亚辛格，伊丽莎白·杰恩·华莱士，
申请(专利权)人：鲁汶大学研究与发展中心，
类型：发明
国别省市：比利时,BE