变异引物的设计方法技术

本发明专利技术提供不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物的新的设计方法。一种引入了变异的引物的设计方法，其中，具备选择基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】变异引物的设计方法
本专利技术涉及引入了变异的引物的设计方法。
技术介绍
现在，核酸扩增法不仅在基础研究领域，在包括流行病学检查、医学诊断、法医学和基因分析的各种领域也是必不可少的方法。核酸扩增法可特异性扩增目标核酸序列，所以作为用于检测目标核酸的存在的高敏感性手段非常有用。作为实施核酸扩增法时的问题之一，可例举非特异性扩增产物的生成。另外，已知引物二聚体的形成和1分子引物内的环结构的形成是产生非特异性扩增的主要原因。引物二聚体或环结构的形成导致的非特异性扩增可能会在例如引物的3'末端区域具有与其本身或其他引物的一定程度的互补性的情况下发生。如定量PCR或等温扩增法这样用于判别有无目标序列的核酸扩增体系中，如果发生这样的非特异性扩增，则产生S/N比下降、出现伪阳性等问题，可能会无法检出目标序列。这样的状况下，提出有抑制作为非特异性扩增反应的原因之一的引物二聚体的产生的方法。专利文献1中揭示了通过使用标记的引物应用FRET的原理，使引物二聚物产生的信号不被检出而提高S/N比的方法。此外，专利文献2中揭示了在3'末端侧的序列内包含选自2'-氟-核苷酸类、2'-氨基核苷酸类和阿拉伯糖核苷酸类的经修饰的核苷酸的引物。作为同样的技术，专利文献3中揭示了在3'末端侧的序列内包含经改变的嘧啶核酸碱基的引物。专利文献2和3中记载了如果使用这些引物，则可抑制引物二聚体的形成。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特表2005-528121号公报专利文献2:日本专利特开2002-291490号公报专利文献3:日本专利特表2008-535518号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题专利文献1中记载的方法在通过读取由扩增产物发出的荧光来检测目标核酸的存在的有无或存在量的定量PCR中是有效的手段，但无法应用于通过嵌入剂检测扩增核酸的体系。此外，由于无法抑制引物二聚体本身的产生，因此无法防止引物二聚体导致非特异性扩增产物的生成引发的引物耗尽。专利文献2和3中记载的方法抑制作为非特异性扩增的原因的引物二聚体的产生本身。但是，这些文献中对引入修饰或改变核苷酸的位置仅有“3个3'末端核苷酸位置内”或“自3'末端起4个核苷酸内”等抽象的记载，对可更有效地抑制非特异性扩增的修饰引物的设计方法没有揭示。这样的状况下，本专利技术要解决的课题在于提供不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物的新的设计方法。解决技术问题所采用的技术方案解决上述课题的本专利技术是一种设计方法，它是用于核酸扩增法的引入了变异的引物的设计方法，其中，具备设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的基础序列设计工序，以及选择该基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。如果采用本专利技术的设计方法，可容易地设计不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物。本专利技术中，较好是对引入至变异引物的变异采用DNA聚合酶不会识别为核苷酸残基的变异。通过采用这样的形态，可设计更不易发生非特异性扩增的引物。本专利技术的优选形态中，变异为选自以下的(A)～(D)的1种或2种以上：(A)与位于所述变异引入部位的前后的核苷酸残基的5'末端及3'末端分别结合5'末端及3'末端而成的核苷酸残基或聚核苷酸；(B)由碳链或PEG链形成的间隔物链；(C)由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链，通式1[化1]通式1中，R表示H或羟基，n表示自然数；(D)经光分解性修饰的间隔物链。通过将引入至变异引物的变异采用(A)～(D)，可设计进一步不易发生非特异性扩增的引物。此外，本专利技术还涉及通过上述的设计方法设计的引物和使用该引物的核酸扩增法。如果采用本专利技术的引物和核酸扩增方法，可减少核酸扩增中的非特异性扩增。本专利技术的核酸扩增方法特别好是适用于等温扩增法。等温扩增法与PCR法不同，不包含双链DNA的变性工序而容易发生非特异性扩增，因此特别好是适用本专利技术的核酸扩增法。此外，本专利技术还涉及用于将上述的设计方法的各工序作为步骤由计算机实施的程序。如果采用本专利技术的程序，可简便地设计不易发生非特异性扩增的变异引物。专利技术的效果如果采用本专利技术，可提供不易发生非特异性扩增的变异引物和核酸扩增法。附图说明图1是表示通常的核酸的结构的图。图2是表示引入了(A)的变异的引物的结构的图。图3是表示作为(B)的变异引入了碳链的引物的结构的图。图4是表示作为(B)的变异引入了PEG链的引物的结构的图。图5是表示作为(C)的变异引入了由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链的引物的结构的图。图6是表示作为(D)的变异引入了经光分解性修饰的间隔物链的引物的结构的图。图7是引物二聚体的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。图8是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记表示不进行核酸合成。2个引物之间的纵向线表示氢键。图9是环结构的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左向的箭头表示进行核酸合成的方向。纵向线表示氢键。图10是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记表示不进行核酸合成。2个引物之间的纵向线表示氢键。图11是引物二聚体的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。图12是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记和左右方向的箭头表示箭头方向的核酸合成在×标记的位置停止。2个引物之间的纵向线表示氢键。图13是表示非特异性扩增产物作为新的非特异性扩增的引物发挥作用而非特异性扩增连锁的情况的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。图14是表示通过变异的引入而抑制由引物的形成导致的非特异性扩增的连锁的模式图。m表示变异。图15是环结构的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左向的箭头表示进行核酸合成的方向。纵向线表示氢键。图16是表示通过变异的引入而抑制由环结构的形成导致的非特异性扩增的连锁的模式图。m表示变异。图17表示试验例1的扩增曲线。图18表示放大了时间轴的试验例1的扩增曲线。图19表示试验例2的扩增曲线。图20表示放大了时间轴的试验例2的扩增曲线。图21是表示通过2个F引物的引物二聚体发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P1的情况的图。图22是表示作为非特异性扩增产物的P1作为引物，R引物作为模板发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P2的情况的图。图23是说明通过引物组2抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示通过引入了变异的2个F引物的引物二聚体发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P1'的情况。图24是说明通过引物组2抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示作为非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种设计方法，它是用于核酸扩增法的引入了变异的引物的设计方法，其中，具备设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的基础序列设计工序，以及选择该基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.30 JP 2016-067252;2016.08.04 JP 2016-154011.一种设计方法，它是用于核酸扩增法的引入了变异的引物的设计方法，其中，具备设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的基础序列设计工序，以及选择该基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外...

【专利技术属性】
技术研发人员：高石真，
申请(专利权)人：大研医器株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP