一种斑鰶SNP标记及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种斑鰶SNP标记及其筛选方法和应用，斑鰶SNP标记筛选包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选；在提取基因组DNA过程中加入环状DNA和甲壳质，能有效提高SNP标记筛选准确度和获取效率；用该方法获得的斑鰶SNP标记，能够为斑鰶种群遗传多样性水平、种群遗传结构等分析的相关研究提供重要的基础。有益效果：本发明专利技术获取斑鰶SNP标记位点的方法具有高通量、低成本，SNP标记筛选准确度高、获取效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种斑鰶SNP标记及其筛选方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是涉及一种斑鰶SNP标记及其筛选方法和应用。技术背景斑鰶(Konosiruspunctatus)隶属鲱形目(Clupeiformes)、鲱科(Clupeidae)、鰶亚科(Dorosomatinae)、斑鰶属(Konosirus)，为沿海暖水性中上层鱼类，广泛分布于中国、朝鲜、韩国以及日本沿海，在我国渤海、黄海、东海、南海均有产出，是中国、日本和朝鲜半岛近海渔业的重要捕捞对象。斑鰶对沿海生态系统的沉积物再悬浮以及水-底界面的物质交换有着重要意义；同时又是多种高营养级鱼类的捕食对象，在海洋食物网结构中扮演着承上启下的关键角色。同时，因其含肉率高、肉质细嫩、味道鲜美，是备受青睐的优质水产品之一，近年来人们对斑鰶的需求量也在稳步增长。由于近年来全球气候变化、环境污染和栖息地破坏等影响，使得斑鰶野生群体数量大大减少。加上持续高强度的捕捞压力，我国斑鰶种群已经出现小型化、低龄化、性早熟等趋势，长此以往势必会对斑鰶的遗传多样性和种质资源造成巨大破坏，产生难以估量的损失。由于其不仅是重要的渔业捕捞对象，还是海洋生态系统变动的关键指示种，在物质循环和能量流动中发挥不可替代的作用，斑鰶资源的衰退不仅会造成其自身渔业产量的大幅减少，而且还会破坏整个沿海生态系统的物质能量循环网结构。因此，加强对斑鰶资源的管理和保护刻不容缓。研究斑鰶的谱系地理结构和种群动态历史，可为斑鰶资源的合理开发利用和管理保护提供重要的科学指导，对衰退种质资源的补充和生态系统的健康发展都具有重要的科学意义。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)指的是某种生物不同个体DNA序列中单个核苷酸点突变产生的多态性，包括置换、颠换、插入或缺失引起的多态现象。SNP是由美国学者Lander于1996年提出的继RFLP、SSR的第三代新型分子标记技术，1998～2002年每年都召开“SNPs与复杂基因组”国际会议以探讨SNPs在复杂基因组中应用，随着PCR、分型检测、DNA芯片等技术的不断发展，SNP趋于高通量、自动化。近年来，分子标记技术逐渐成为研究水产动物遗传学的重要手段，SNP作为第三代遗传标记，位点数量多、密度广、遗传多样性高以及自动化程度强，能够显示其他分子标记技术难以检测到的遗传信息多态性，故而，SNP标记技术对于水产动物遗传学研究具有重要意义。基于先进的简化基因组测序技术获得高密度的SNP位点，可从全基因组层面查明中国沿海黄鲫种群的遗传多样性水平、种群遗传结构等重要群体遗传学参数，能够克服传统方法中依赖于单个或少数基因位点来评估海洋生物群体遗传和进化机制带来的不确定性和分辨率不高的问题，将为黄鲫的有效管理及合理保护提供背景知识，并有助于推动中国海洋鱼类群体基因组学研究向更深发展。目前获取基因信息数据的方法主要有两种：基因分型和基因测序。基因分型主要是利用已知的单核苷酸多态性(SNP)位点侧翼的碱基序列设计探针，并将探针固定在基因芯片上。当待测样本的DNA与基因芯片上的探针序列互补杂交并通过扫描荧光信号来探知杂交，便可鉴定样本DNA上这些探针位点(SNP位点)的基因型。而基因测序是对目标DNA进行碱基序列测定，并进行相关分析。现有技术如授权公告号为CN105238859B的中国专利技术专利，公开了一种获取鸡全基因组高密度SNP标记位点的方法，包括以下步骤：(1)预测用EcoRI与MseI的双酶切鸡基因组所获得的酶切片段分布情况；(2)根据EcoRI与MseI的酶切片段分布特点设计通用接头、条形码接头及PCR扩增引物；(3)构建简化基因组测序文库；(4)利用步骤(3)构建的文库进行上机测序；(5)根据测序结果获得SNP标记位点；该专利技术获取每个SNP标记位点的成本比传统芯片技术降低一个数量级，且方法技术稳定，重复性高。然而该专利技术测序程序较复杂，目标DNA获取纯度低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种斑鰶SNP标记筛选方法，采用聚合酶链式反应和串联RAD标签测序技术筛选斑鰶SNP标记，具有高通量、低成本，SNP标记筛选准确度高、获取效率高等优点。本专利技术的目的还在于利用斑鰶SNP标记筛选方法获得高密度的SNP位点，可从全基因组层面查明中国沿海斑鰶种群的遗传多样性水平、种群遗传结构等重要群体遗传学参数，能够克服传统方法中依赖于单个或少数基因位点来评估海洋生物群体遗传和进化机制带来的不确定性和分辨率不高的问题，将为斑鰶的有效管理及合理保护提供背景知识，并有助于推动中国海洋鱼类群体基因组学研究向更深发展。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种斑鰶SNP标记筛选方法，包括以下步骤：提取基因组DNA：提取用溶液包括提取液I和提取液II；其中提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.8-8.2；具体步骤为：将斑鰶肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融2-3次，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用；RAD文库构建与高通量测序：包括如下步骤：A1.酶切：利用选定内切酶对N个基因组DNA分别进行酶切反应，获得N份酶切片段，N为大于2的整数；A2.接头连接：对N份酶切片段分别连接接头，即设计N对接头组合，得到N份连接产物，每份酶切片段两端连接的接头均设计有SapI酶的酶切位点和用于实现标签串联的特征序列以及扩增引物结合的通用序列，根据所添加的接头决定了N组酶切片段的串联顺序；A3.连接产物扩增：将步骤A2所得到的N份连接产物分别利用不同的生物素引物和普通引物组合进行PCR扩增，富集连接有接头的酶切片段，切胶回收PCR产物，采用同样的方法扩增4-8个循环，扩增后得到N份富集的PCR产物；将N份富集的PCR产物等量混合，并进行纯化；A4.串联标签文库：利用SapI酶对混合并纯化后的N份PCR产物进行酶切，切除了酶切片段两端通用的接头和引物序列，使接头上带有的特征序列保留并形成末端粘性突出，N份PCR产物形成了可直接串联的标签，根据接头上的特征序列互补配对，使N份标签文库按照顺序依次串联，得串联长标签；A5.串联长标签富集：将串联长标签经凝胶纯化后利用引物进行PCR扩增，引入barcode构建串联标签文库；A6.文库测序：将串联标签文库利用Illunima测序平台进行测序；原始序列数据过滤：过滤掉原始测序数据中包含带Adaptor信息、低质量碱基和未测出的碱基的readspair；原始测序数据中所包含的这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前将这些干扰信息去除掉，所得到的有效数据为后续数据的精确分析提供了保证；SNP信息位点检测与筛选：将过滤所得的readspair通过BWA软件与已发表的斑鰶基因组草图进行比对，接着采用SAMTOOLS0.1.19中的贝叶斯算法模型以最大reads深度为1000的参数设置进行SNP的检测，过滤得斑鰶SNP标记位点。作为优选，环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA；可根据需要选用不同大小的环状DNA，只要所加环状DNA与所构建的目标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑鰶SNP标记筛选方法，包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选，其特征在于：所述提取基因组DNA的步骤为：将斑鰶肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融2‑3次，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用。

【技术特征摘要】
1.一种斑鰶SNP标记筛选方法，包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选，其特征在于：所述提取基因组DNA的步骤为：将斑鰶肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融2-3次，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用。2.根据权利要求1所述的一种斑鰶SNP标记筛选方法，其特征在于：所述环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA。3.根据权利要求1所述的一种斑鰶SNP标记筛选方法，其特征在于：所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.8-8.2。4.根据权利要求1所述的一种斑鰶SNP标记筛选方法，其特征在于：所述RAD文库构建与高通量测序，包括如下步骤：A1.酶切：利用选定内切酶对N个基因组DNA分别进行酶切反应，获得N份酶切片段，N为大于2的整数；A2.接头连接：对N份酶切片段分别连接接头，即设计N对接头组合，得到N份连接产物，每份酶切片段两端连接的接头均设计有SapI酶的酶切位点和用于实现标签串联的特征序列以及扩增引物结合的通用序列，根据所添加的接头决定了N组酶切片段的串联顺序；A3.连接产物扩增：将步骤A2所得到的N份连接产物分别利用不同的生物素引物和普通引物组合进行PCR扩增，富集连接有接头的酶切片段，切胶回收PCR产物，采用同样的方法扩增4-8个循环，扩增后得到N份富集的PCR产物；将N份富集的PCR产物等量混合，并进行纯化；A4.串联标签文库：利用SapI酶对混合并纯化后的N份PCR产物进行酶切，切除了酶切片段两端通用的接头和引物序列，使接头上带有的特征序列保留并形成末端粘性突出，N份PCR产物形成了可直接串联的标签，根据接头上的特征序列互补配对，使N份标签文库按照顺序依次串联，得串联长标签；A5.串联长标签富集：将串联长标签经凝胶纯化后利用引物进行PCR扩增，引入barcode构建串联标签文库；A6.文库测序：将串联标签文库利用Illunima测序平台进行测序。5.根据权利要求4所述的一种斑鰶SNP标记筛选方法，其特征在于：所述A1步骤中内切...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炳舰，江丽华，柳意樊，吕振明，刘立芹，龚理，张伟男，刘珠，朱科桦，段雯，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33