一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，涉及药材鉴定技术领域。本发明专利技术所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。利用本发明专利技术的引物对或试剂盒鉴定美洲大蠊操作简单，样品限制性低，检测特异性高，稳定性好，实用性广。针对不同来源的美洲大蠊样品，无论是鲜品或干品、昆虫药材炮制品或粉末状样品、全虫或部分虫体、幼虫或成虫都具有98％以上的准确度和精确度。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用
本专利技术属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用。
技术介绍
美洲大蠊(PeriplanetaamericanaLinn.)是长期应用于民间的动物药药材，常以干燥或鲜成虫入药，主治儿童疳积、扁桃腺炎、身体包块、痈疮肿痛和蜈蚣叮咬等。近年来研究表明，美洲大蠊作为昆虫药物，临床应用记录显示其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、促进组织修复、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等药理作用，其药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对美洲大蠊药材的真伪鉴定是入药及进行药理学研究的基础。目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征，而在我国的药材市场，美洲大蠊药材通常以粉末或炮制品等形式入药。由于传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，因此基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差、可信度低，导致药用美洲大蠊的鉴定存在很大困难。由于传统的性状鉴别方法无法准确、快速的鉴定药材市场贩售的美洲大蠊药材，导致有部分伪品(例如药效不及美洲大蠊的澳洲大蠊、德国小蠊、甚或其它科属的昆虫)在市场内流通，市场较为混乱。因此，该昆虫药物的药材鉴定及原料药饮片的质量控制等均亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类学方法的缺陷及不足。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，实现美洲大蠊作为昆虫原料药材的快速鉴定，可缩短鉴定时间，提高鉴定结果的准确性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含上述引物对，还包括PCRBuffer。优选的，所述PCRBuffer包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。本专利技术还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。优选的，所述鉴定包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCRBuffer和步骤1)得到的所述模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物；3)将步骤2)得到的所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。优选的，所述样品包括鲜品或干品。优选的，所述样品包括幼虫或成虫的全虫或部分虫体。优选的，每50μL所述PCR扩增的反应体系包括：蒸馏水19μL，PCRBuffer25μL，引物各2μL和模板DNA2μL。优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。本专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，可实现美洲大蠊作为昆虫原料药材的快速鉴定，缩短鉴定时间，提高鉴定结果的准确性。在本专利技术实施例中，鉴定准确度达98％以上。附图说明图1为本专利技术实施例3的琼脂糖凝胶电泳图；图2是本专利技术实施例4的琼脂糖凝胶电泳图。图3为本专利技术实施例5的琼脂糖凝胶电泳图；图4为本专利技术实施例6的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式本专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.2:TATGTACTACCATGAGGACAAATATC；和SEQIDNO.3：ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT所示。本专利技术所述引物对优选根据美洲大蠊的DNA条形码基因设计，所述DNA条形码基因优选为Cytb基因。本专利技术所述Cytb基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示:ATTTTGAGGAGCAACTGTAATTACAAACCTTTTATCAGCAATTCCATACCTTGGAATTGATTTAGTACAATGAGTATGAGGTGGTTTTGCAGTAGATAATGCAACACTTAATCGATTTTTTACATTCCATTTTCTTCTCCCATTTATTGTAATAGCAGCTGTAATAGTCCATTTGCTATTTTTACACCAAACAGGATCAAATAACCCTACAGGATTAAATAGAAATATTGATAAAATCCCATTTCATCCTTATTTCACAATTAAAGATGTTGTAGGATTTCTAATCCTAATTATATTATTAACAATATTATCACTAAAAGAACCATATATTCTAGGAGATCCAGATAATTTTATCCCAGCTAATCCATTAGTTACCCCAGTCCATATTCAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATACGCAATTTTACGATCA。本专利技术提供了一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含上述引物对，还包括PCRBuffer。本专利技术所述PCRBuffer优选包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。本专利技术还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。本专利技术所述鉴定优选包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCRBuffer和步骤1)得到的所述模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物；3)将步骤2)得到的所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。本专利技术在鉴定所述美洲大蠊时，提取样品基因组DNA，得模板DNA。本专利技术对所述样品的种类或来源并没有特殊限定，优选包括鲜品或干品，也可以包括幼虫或成虫的全虫或部分虫体。本专利技术对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，优选包括苯酚-氯仿法。本专利技术所述模板DNA的浓度优选为20～50ng/μL。得模板DNA后，本专利技术将引物对、PCRBuffer和模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物。当本专利技术所述PCR扩增体系为50μL体系时，优选包括蒸馏水19μL，PCRBuffer25μL，引物各2μL和模板DNA2μL。本专利技术所述引物的浓度优选为5～15μmol/L，更优选为8～12μmol/L，最优选为10μmol/L。本专利技术所述PCR扩增的反应程序优选包括：94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。本专利技术在进行所述PCR扩增时，优选设置阳性对照。本专利技术所述阳性对照的模板DNA为核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因。得扩增产物后，本专利技术将所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。本专利技术对所述琼脂糖凝胶电泳的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本专利技术在鉴定样品是否是美洲大蠊时，优选的将所述模板DNA的扩增产物与阳性对照的扩增产物在琼脂糖凝胶上的条带进行对比，两者在同一位置或者是扩增产物的大小为433bp，可以判断所述样品为美洲大蠊。下面结合实施例对本专利技术提供的鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1将美洲大蠊的肌肉组织在75％的酒精中浸泡3小时，然后将其浸没于纯水中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定美洲大蠊用引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定美洲大蠊用引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。2.一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含权利要求1所述引物对，还包括PCRBuffer。3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述PCRBuffer包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。4.权利要求1所述引物对或权利要求2～3任一项所述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鉴定包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCRBuffer和步骤1)得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿福能，张成桂，沈咏梅，陈壮志，刘彬，李贵轲，马秀英，魏永凯，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：云南,53