猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记制造技术

本发明专利技术属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记。通过基因芯片技术对登陆号为ASGA0082606基因进行分型，筛选得到一种与猪33日龄红细胞数目性状相关的分子标记，该标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第101位的碱基处存在一个C/T的等位基因突变。当SEQ ID NO：1所示序列上的第101位核苷酸为T时，表明猪具有更高的红细胞数目。本发明专利技术为猪免疫性状尤其是红细胞数目的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

【技术实现步骤摘要】
猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记
本专利技术属于猪的分子标记筛选
，具体涉及猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记。本专利技术的分子标记可用于猪红细胞数目(RBC)性状的预测。
技术介绍
我国一直是猪肉生产和消费大国，猪肉是我国肉类食品消费最多的品种，每年猪肉消费量约占全球的一半(陶炜煜等，2017)。随着规模化、现代化养殖的盛行，国内生猪生产水平逐渐提高，但饲养密度和强度大随之而来的疾病防控难度也日趋增加，规模化猪场一旦爆发流行性或者传染性疾病，将会给猪场带来致命的打击(张文启，2015)。近年在我国境内开始流行的圆环病毒病，主要侵害青年猪和仔猪，患病猪只食欲下降且表现为渐进性消瘦(钟细平，2016)，严重推迟生猪出栏时间甚至死亡，极大地增加猪场成本。且诸如蓝耳病、圆环病毒病等具有强烈的免疫抑制作用的疾病，患病猪只疫苗免疫水平较低(李文太，2017)，而疫苗免疫是我国猪场传染性疾病防控的主要手段。再者，传染病的血清型和变异株一般较多，也给疾病防控和疫苗免疫增加难度，猪病的防控成为猪生产的一大难点。2018年以来，猪价低迷，同时饲料原料价格较高、环保监控力度更加严格，猪场如何能在低迷的市场行情和相对较高的生产成本下具有竟争优势，降低疾病防治成本是重要手段之一。而且，季节性爆发的流行性传染病一般具有多种血清型和变异株且多病原间经常存在混合感染、继发感染或协同感染等情况(陈焕春，2014)，加大疫苗免疫和疾病防控难度。且使用抗生素治疗容易出现耐药性，影响治疗效果，提高猪只免疫力才是防控疾病的关键(赵瑞丽，2010)。而抗病育种是公认的猪病综合防控的重要环节，抗病育种是在遗传的基础上改良猪的抗病性能，培育具有抗病性能或免疫力较高的优质高产猪，力图从根本上解决生猪免疫力和抗病力较低的问题，受到国内外学者的高度重视，并取得了一系列成果。免疫系统是动物抵抗病原侵害的天然屏障，免疫系统的强弱直接决定了动物抵抗疾病的能力和疫苗免疫能力，报道的猪的Cav1基因能在阻止病原微生物入侵宿主过程中起关键作用(Liu等，2011)，Toll样受体家族(TLRs)(戴超辉等，2018)和白细胞介素ILs在猪群免疫调控中具有重要作用(Suzuki等,2001)，苏太猪FUT1的M307位点对大肠杆菌F18菌株具有很好的抗性(Bao等，2012)，这些研究为抗病育种提供了很好的参考依据。随着食品安全的重视及兽药使用的规范和限制，抗病育种将成为猪场疾病防控的重要手段。红细胞是血液的主要细胞成分，参与机体许多免疫应答和免疫调节(甘慧等，2004)，是一种天然免疫刺激剂和调节剂(甘慧等，2005)，数量巨大且分布较广，其含有CR1、CR3、CD8、CD59、DAF、IL-8受体等多种免疫相关物质，具有杀伤抗原和清除免疫复合物的能力(郭峰，1995)，在动物天然抗病免疫中发挥重要作用，在一定程度上红细胞数量的多少会直接影响机体的免疫水平。因此，寻找与红细胞数量相关的基因或分子标记，对提高猪的抗病能力具有重要的现实意义，血液分布于机体全身，红细胞免疫作用面广，筛选出与猪红细胞数显著相关的分子标记及基因对抗病育种具有重要意义。本专利技术中发现的SNP与猪的红细胞数(RBC)性状的相关性达到了极显著水平，为家猪免疫及生长性状的研究提供了新的遗传资源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，完善家猪抗病育种分子标记资源的发掘，利用基因芯片技术对SNP进行分型，并使用全基因组关联分析(GWAS)筛选与注射聚肌胞后对猪细胞数目(RBC)性状相关的SNP，为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源。本专利技术的技术方案如下所述：申请人通过基因芯片技术并参阅Ensemble，得到猪9号染色体基因间区核苷酸片段，该片段与33日龄猪红细胞数性状相关，该片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。具体核苷酸序列如下所示：CGGTACCTCTGGGGAAGGCGCAGAAGAAATTTACAGAGTATATTTTTGGTCACACTTAAGTCTTCCTTAAAGTGACCTGGCCTCTCCCTCAGTCAAAGGAY(C/T)TCTGAGTTGGTGAACAGCTTTCTCCCAGCAAACTGAGTGGAAAGCTACAAATTATCACTATGGCTGTTTGAATCAGGTTTCTACCCACCTCAATAATTCC，上述序列的第101位碱基处的Y是C或T，该突变导致红细胞数性状发生改变。且当SEQIDNO：1上的第101位核苷酸为T时，表明猪具有更高的红细胞数目。上述序列可以作为检测猪红细胞数目性状尤其是检测33日龄猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记。申请人提供了一种筛选猪红细胞数目性状相关尤其是检测33日龄猪红细胞数目性状相关SNP分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：①提取猪耳组织基因组DNA，进行DNA质量检测。②利用基因芯片技术进基因分型。③采用基于固定模型和随机模型的方法，利用R统计环境下的MVP软件包进行全基因组关联分析(GWAS)。具体的回归模型如下：(1)固定模型yi＝Mi1b1+Mi2b2+…+Mitbt+Sijdj+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；Mi1，Mi2，...，Mit分别是t个假设QTN的基因型；b1，b2，...，bt分别是t个遗传标记的效应值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～N(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差。(2)随机模型yi＝ui+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～N(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差；ui是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行了主成分分析，将前三个主成分作为协变量加入模型中。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果：本专利技术可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本专利技术具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。附图说明序列表SEQIDNO：1是本专利技术克隆的猪9号染色体基因间区的核苷酸片段。该片段即是本专利技术筛选的分子标记，序列长度为201bp，在该序列的101位碱基处的Y存在一个C/T等位基因突变。图1：本专利技术的总体技术流程示意图。图2：本专利技术克隆的9号染色体基因间区序列，该序列即是本专利技术的分子标记序列。附图标记说明：在图2所示序列的第101位碱基处存在一个C/T等位基因突变(101bp处的英文字母“Y”代表突变位点)。图3：本专利技术的曼哈顿图。附图标记说明：箭头所指黑色圆圈标记的为本专利技术筛选的分子标记，该标记位于猪第9号染色体上的基因间区序列。具体实施方式实施例1：基因分型检测(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸F2代群体的耳朵组织DNA1)将杜洛克×二花脸F2代猪群体(群体样本由广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳组织样在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，再加入10％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5％，摇匀。在55℃水浴中温育过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测33日龄猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：CGGTACCTCTGGGGAAGGCGCAGAAGAAATTTACAGAGTATATTTTTGGTCACACTTAAGTCTTCCTTAAAGTGACCTGGCCTCTCCCTCAGTCAAAGGAY(C/T)TCTGAGTTGGTG AACAGCTTTCTCCCAGCAAACTGAGTGGAAAGCTACAAATTATCACTATGGCTGTTTGAATCAGGTTTCTACCCACCTCAATAATTCC，上述序列的101bp处的Y是C或T，导致9号染色体基因间区的多态性。

【技术特征摘要】
1.一种检测33日龄猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：CGGTACCTCTGGGGAAGGCGCAGAAGAAATTTACAGAGTATATTTTTGGTCACACTTAAGTCTTCCTTAAAGTGACCTGGCCTCTCCCTCAGTCAAAGGAY(C/T)TCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘向东，王梦芬，杜小勇，赵书红，李新云，尹立林，唐振双，赵志超，朱猛进，张杰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42