细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的一系列新应用。本发明专利技术以细粒棘球绦虫线粒体ND6基因为分子诊断标记，通过PCR检测犬是否感染细粒棘球绦虫，具有很高的可靠性、特异性和灵敏性，并能够在感染早期及时检测出犬粪便中的细粒棘球绦虫，可用于犬感染细粒棘球绦虫的流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的应用。
技术介绍
细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，Eg)的生活史较为复杂，要通过中间宿主人或某些家畜(如牛、羊等食草动物)和终末宿主犬科动物来共同完成。细粒棘球绦虫的中绦期幼虫－细粒棘球蚴主要寄生在中间宿主的肝脏和肺脏内，从而引起细粒棘球蚴病(囊型包虫病)(Echinococcosis)。该病为一种人畜共患寄生虫病，呈世界性分布，其中我国属高发地区之一，主要流行于青海、新疆、西藏、四川西北部牧区以及宁夏，目前我国至少有368个流行县。现该病已被列为我国《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2020)年优先防治和重点防范的动物疫病。犬是细粒棘球绦虫最重要的终末宿主和传染源。犬吞食棘球蚴后，原头蚴在其小肠内经40～50天便可发育为成虫，成虫在犬体内的寿命为5～6个月。成虫孕节及虫卵随犬粪排出并污染食料、水源及环境，中间宿主经口食入虫卵而受到感染，从而引起囊型包虫病。如能及时准确地检测出犬感染细粒棘球绦虫的情况，对人和动物包虫病的防控具有重要意义。检测犬感染细粒棘球绦虫的传统方法主要有：剖检法、槟榔碱泻下法和虫卵漂浮检查法。剖检法检测结果直观，但操作繁琐，可能出现漏检情况；槟榔碱泻下法具有较好的应用价值，但其导泄率只有70％左右，且可能会造成环境污染。虫卵漂浮检查法虽简单方便易行，但仍会出现漏检情况。另外，由于棘球属绦虫的虫卵与其它带科绦虫的虫卵在形态上难以区别，因此导致该法特异性不高。粪抗原ELISA检测法的原理是虫体寄生于宿主肠道内,其代谢物、分泌物、节片、虫卵等虫体组织(称粪抗原)可随宿主粪便排到体外，通过制备特异抗体可检测粪抗原。该法简单易行，对检测样本要求不严格，适合在基层推广使用；并且张旭等曾报道，当犬感染5条虫体时即可在其感染16d后检测出阳性，具有早期诊断价值。该法的特异性虽可高达97％，敏感性却受到感染程度的影响，其中感染虫体数在100条以上时敏感性可达92.0％，但在100条以下时，其敏感性只有29.0％。此外，该法在带科绦虫种属相近的虫体之间可能会出现严重的交叉反应，因此，粪抗原ELISA法检测结果可能出现较高的假阳性。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)针对靶基因的6个区域设计4对引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件(65℃)下约1h即可扩增出目的片段。该法所需设备简单，反应快速，产物检测便捷，特异性强。陈璐等曾报道当犬感染细粒棘球绦虫大于10000条时，在其感染后18d即可检测到。此外，在对犬粪便进行检测时，BstDNA聚合酶的活性几乎不受粪便抑制物的影响，这也使得LAMP法的灵敏度比常规PCR高。但也因其过高的灵敏度，少量的基因污染就会导致该法实验结果呈假阳性，需另外的检测方法对此验证；且LAMP法的电泳图为多条带，即使有非特异性扩增的产生，也不易辨认出来。同时，也因非单一条带，LAMP法无法通过基因测序而进行基因分型。另外，该法要求靶序列长度控制在300bp以下，对引物要求较高，要筛选出合适的引物需要耗费大量的工作。动物粪便易于收集保存且粪便中感染源的数量庞大，其病原体遗传物质可以来源于寄生虫的虫卵，或寄生虫虫体的细胞及组织碎片等，仅用少量的粪便即可提取到目的基因，因此粪便PCR检测法也逐渐成为了检测动物疾病的重要途径。相比于病原学检测和免疫学检测方法，PCR检测方法具有快速、准确、敏感、特异等优点，也可实现对形态难以区分的带科绦虫的鉴定。自Bretagne等(1993)报道用PCR技术从狐狸粪DNA中检测多房棘球绦虫感染之后，该技术在犬粪棘球绦虫卵检测中也得到广泛的应用。Dinkel等(1998)应用巢式PCR检测法对多房棘球绦虫12SrRNA片段(373bp)进行了扩增,结果最低检测到1个虫卵，而细粒棘球绦虫等11种其他绦虫均无非特异性扩增，特异性为100％。Abbasi等(2003)对目标重复序列(EgG1HaeIII)(133bp)进行了PCR扩增，其敏感度很高，最低也可检测出一个虫卵。但其特异性较差，同时扩增的水泡带绦虫、多头带绦虫、羊带绦虫也具有相同的133bpDNA重复序列。Stefania等(2004)对细粒棘球绦虫G1株的12SrDNA片段(255bp)进行PCR扩增，敏感性达到对一个虫卵的检测，同时对细粒棘球绦虫另外5种基因型和其它14种绦虫基因进行扩增，结果仅特异性的扩增出细粒棘球绦虫G1型，检测结果无假阳性。此外，Dinkel等(2004)还根据细粒棘球绦虫G1株线粒体12SrRNA基因序列(254bp)设计引物，鉴别了绦虫不同属和细粒棘球绦虫不同基因型(共16种)，其特异性达100％，同时其敏感度也达到0.25pg的DNA含量。虽然PCR技术由于具有较高的敏感性、特异性等特点被广泛地应用于临床检测，但是选择合适可靠的分子诊断标记对动物疾病的检测是十分重要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的新应用，使得所述ND6基因作为检测细粒棘球绦虫的分子诊断标记时，具备较高的准确度、灵敏度和特异性，并可较早的检出细粒棘球绦虫。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：细粒棘球绦虫线粒体ND6基因作为检测细粒棘球绦虫的分子诊断标记的应用；细粒棘球绦虫线粒体ND6基因(ND6)全序列长度短(456bp)，结构简单无内含子，进化速率适中，序列变异丰富，突变率显著高于核DNA，目前已被广泛应用于牦牛、鱼类及昆虫的种群遗传结构分析，但是尚未报道用于犬感染细粒棘球绦虫的检测中。本专利技术利用PCR技术，将从线粒体基因组中筛选出的ND6全基因序列作为分子诊断标记并对该基因进行扩增，建立了一种检测犬粪中细粒棘球绦虫DNA的PCR方法。在我国，犬小肠内寄生的绦虫除细粒棘球绦虫外，最常见的还有多房棘球绦虫、多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、犬复孔绦虫、孟氏迭宫绦虫等其他绦虫。另外，犬弓首蛔虫也是很常见的寄生虫。本专利技术以ND6基因为分子诊断标记分别对以上八种寄生虫进行了PCR检测，结果表明除细粒棘球绦虫外均未扩增出目的条带，说明以ND6基因为分子诊断标记具有高度的种特异性，不会发生交叉反应。为了进一步增加这种特异性，本专利技术在以ND6基因为主要分子诊断标记同时，加入其上游的部分tRNA-GLU序列(38bp)和下游的部分tRNA-TYR序列(64bp)组成更佳的分子诊断标记。在测定以ND6基因为分子诊断标记的灵敏度时，将目的基因按比例稀释(273ng-4pg)，结果表明随着DNA浓度的逐渐降低，目的条带亮度也在逐渐减弱直到稀释至4pg时阳性条带才完全消失。现有报道中，Abbasi(2003)曾检测到单个细粒棘球绦虫虫卵的基因(EgG1HaeIII)DNA含量为8pg，这就表明以ND6基因为分子诊断标记具有较高的灵敏度，即使只有1个细粒棘球绦虫虫卵也可被检测到。此外，为验证以ND6基因为分子诊断标记的可靠性，本专利技术对人工感染原头蚴的犬粪进行了PCR检测，结果表明当犬人工感染约50000只原头蚴时，PCR在感染第13天便可从犬粪中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细粒棘球绦虫线粒体ND6基因作为检测细粒棘球绦虫的分子诊断标记的应用。

【技术特征摘要】
1.细粒棘球绦虫线粒体ND6基因作为检测细粒棘球绦虫的分子诊断标记的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述细粒棘球绦虫线粒体ND6基因为ND6野生型基因；或为ND6野生型基因上游1-100bp、ND6野生型基因和ND6野生型基因下游1-100bp组成的序列；或在ND6野生型基因序列上缺失、添加或取代一个或多个碱基的序列；或对ND6野生型基因进行修饰的序列；所述缺失、添加或取代一个或多个碱基以及修饰不会影响以ND6基因为靶基因设计的扩增引物的PCR扩增。3.细粒棘球绦虫线粒体ND6基因在制备检测细粒棘球绦虫的分子诊断标记中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述细粒棘球绦虫线粒体ND6基因为ND6野生型基因；或为ND6野生型基因上游1-100bp、ND6野生型基因和ND6野生型基因下游1-100bp组成的序列；或在ND6野生型基因序列上缺失、添加或取代一个或多个碱基的序列；或对ND6野生型基因进行修饰的序列；所述缺失、添加或取代一个或多个碱基以及修饰不会影响以ND6基因为靶基因设计的扩增引...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，詹佳飞，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51