【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及生物，具体是一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的引物对、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、石斛属dendrobium sw是兰科最大的属之一，全球约1500种，中国有78种，产秦岭以南诸省区，尤以云南南部为多。石斛属植物是植物界集药用和观赏价值于一身的典型代表，既有“四大观赏洋兰”之美称，又多具益胃生津、滋阴清热等功效，在《神农本草经》中，“石斛”被列为上品，已有2000多年的药用历史。紫皮石斛(dendrobium devonianum paxt)，又称紫草，其作为鲜石斛和紫皮枫斗在市场上流通，药用价值高，需求量大。紫皮石斛是目前人工集约化栽培规模仅次于铁皮石斛的种类，据报道称，紫皮石斛多糖含量(21.09％)比铁皮石斛(18.24％)稍高，市场价值很高。杯鞘石斛(d.gratiosissimum)和紫皮石斛外观十分相似，仅凭外形难以区分，鉴别难度大，加工成枫斗后更难区分。然而，不同石斛的药用成分及疗效存在差异，影响临床用药的有效性。
2、传统的鉴定方法包括hplc指纹图谱法已被应用于紫皮石斛和杯鞘石斛的鉴定，但该方法受实验条件限制较大，耗时且所需实验设备成本较高。随着现代分子生物技术的发展，一些nr dna分子标记也被用于鉴定石斛属及其近缘物种，但该方法的引物特异性不高，未进行针对性的引物设计。因此，有必要研究一种高特异性dna分子标记、不在花期或药材状态下快速、准确鉴别紫皮石斛和杯鞘石斛的方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一
2、本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
3、本专利技术提供了一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的引物对，所述引物对包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术还提供了一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
5、本专利技术还提供了上述引物对或上述试剂盒在区分紫皮石斛和杯鞘石斛中的应用。
6、本专利技术还提供了一种区分紫皮石斛和杯鞘石斛的方法，包括以下步骤：
7、以待测样品基因组dna为模板，利用上述引物对或上述试剂盒配制pcr反应体系，进行pcr扩增；
8、若扩增产物的长度为800-900bp，则待测样品为紫皮石斛；
9、若扩增产物的长度为300-400bp，则待测样品为杯鞘石斛。
10、优选的，所述pcr扩增反应程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，终止温度为12℃。
11、优选的，所述pcr扩增的反应体系以25μl计，包括模板dna 2μl，上、下游引物各1μl，2×taq plus pcr mastermix 12.5μl，ddh2o 8.5μl。
12、优选的，所述上游引物和下游引物额浓度均为10μmol/l；所述模板的浓度为30～100ng/ul
13、优选的，所述2×taq pcr mastermix购自北京鸿跃创新科技有限公司生产的货号为dm1220。
14、优选的，所述扩增产物的鉴定方法包括电泳检测或测序；
15、当鉴定方法为测序时，若扩增产物的序列与紫皮石斛序列一致的支持率大于99％，则待测样品为紫皮石斛；所述紫皮石斛序列如seq id no.3所示；
16、若扩增产物的序列与杯鞘石斛序列一致的支持率大于99％，则待测样品为杯鞘石斛；所述杯鞘石斛序列如seq id no.4所示。
17、优选的，所述待测样品包括新鲜组织和/或dna未降解的干品组织。
18、有益效果：
19、本专利技术提供了一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的引物对，所述引物对包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。本专利技术对紫皮石斛和杯鞘石斛的叶绿体全基因组进行测序，发现6个基因间区，包括psaj-rpl33、psbb-psbt、rps7-trnv(gac)、trnc(gca)-petn、trne-(uuc)-trnt(ggu)、trnl-caa-trni-cau在两个物种中存在显著差异；本专利技术基于上述差异序列区间设计特异性引物对，利用该引物对对待测石斛样品进行pcr扩增，根据扩增产物可以特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛，可以在非花期或dna未降解的中药干品状态下准确鉴定紫皮石斛和杯鞘石斛。
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1.本专利技术提供了一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，引物对可对待测石斛样品进行PCR扩增，根据扩增产物可特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛，可在不是花期时或DNA未降解的药材干品状态准确鉴定紫皮石斛和杯鞘石斛。
2.一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Prime6引物对，试剂盒可以特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛。
3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒在区分紫皮石斛和杯鞘石斛中的应用，其特征在于，引物对或试剂盒可以特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛。
4.一种区分紫皮石斛和杯鞘石斛的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品基因组DNA为模板，利用Prime 6对或上述试剂盒配制PCR反应体系，进行PCR扩增；若扩增产物的长度为800-900bp，则待测样品为紫皮石斛；若扩增产物的长度为300-400bp，则待测样品为杯鞘石斛。
5.根据
6.根据权利要求4或5所述的一种区分紫皮石斛和杯鞘石斛的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括模板DNA 2μL，上、下游引物各1μL，2×Taq Plus PCRMasterMix 12.5μL，dd H2O 8.5μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Prime 6上游引物和下游引物浓度均为10μmol/L；所述模板的浓度为30～100ng/uL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述2×Taq PCR MasterMix购自北京鸿跃创新科技有限公司生产的货号为DM1220。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的鉴定方法包括电泳检测或测序；当鉴定方法为测序时，若扩增产物的序列与紫皮石斛序列一致的支持率大于99％，则待测样品为紫皮石斛；所述紫皮石斛序列如SEQ IDNo.3所示；若扩增产物的序列与杯鞘石斛序列一致的支持率大于99％，则待测样品为杯鞘石斛；所述杯鞘石斛序列如SEQ ID No.4所示。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括新鲜组织和/或DNA未降解的干品组织。
...【技术特征摘要】
1.本发明提供了一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示，引物对可对待测石斛样品进行pcr扩增，根据扩增产物可特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛，可在不是花期时或dna未降解的药材干品状态准确鉴定紫皮石斛和杯鞘石斛。
2.一种特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括prime6引物对，试剂盒可以特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛。
3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒在区分紫皮石斛和杯鞘石斛中的应用，其特征在于，引物对或试剂盒可以特异性区分紫皮石斛和杯鞘石斛。
4.一种区分紫皮石斛和杯鞘石斛的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品基因组dna为模板，利用prime 6对或上述试剂盒配制pcr反应体系，进行pcr扩增；若扩增产物的长度为800-900bp，则待测样品为紫皮石斛；若扩增产物的长度为300-400bp，则待测样品为杯鞘石斛。
5.根据权利要求4所述的一种区分紫皮石斛和杯鞘石斛的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退...
【专利技术属性】
技术研发人员：段宝忠，周莹，刘颖琳，尚明越，张满常，徐志超，黄林芳，和福美，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：
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