人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞，该子宫内膜组织来源的间充质干细胞是从人的子宫内膜组织中分离得到。通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液后，直接接种于间充质干细胞培养基中进行培养及传代纯化，或者采用密度梯度离心法分离得到包含有间充质干细胞的细胞群，接种于间充质干细胞培养基中，进行培养及传代纯化，最终获得了新的具有强增殖能力及迁移分化能力的间充质干细胞。本发明专利技术的间充质干细胞可以作为制备预防或治疗缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、其他年龄相关退行性疾病的药物得到应用，也可以用于制备包括医学美容、亚健康人群保健、老年个体年轻化等方面的产品。

【技术实现步骤摘要】
人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法
本专利技术涉及一种新的干细胞，特别是一种从人体子宫内膜组织中提取的间充质干细胞。本专利技术还涉及该子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法。
技术介绍
干细胞是一种具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，具有修复受损组织细胞的潜能，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的种子细胞，是各种疾病尤其是各种难治性疾病可能的新的有效治疗方法。根据发育阶段不同，干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞，其中成体干细胞因其来源广泛，致瘤性相对较低等特点，具有广泛的应用前景。成体干细胞中的间充质干细胞更因其易分离培养，扩增纯化，免疫原性低等特点，成为干细胞移植及组织工程领域理想的种子细胞。不仅为包括心梗、脑梗等在内的缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、其他年龄相关的退行性疾病及其他各种不同疾病的治疗提供了新的希望，同时在医学美容领域，亚健康人群自我保健，乃至老年个体年轻化等方面都提供了新的思路。研究表明，间充质干细胞具有促进损伤修复、改善多种疾病预后的功能。增殖活力旺盛的年轻间充质干细胞进行移植，能够促使受体对修复干细胞的反应性增强，促进受体的年轻化。间充质干细胞发挥其修复治疗功能需要具备两个要素，一是数量充足，一是包括自我更新增殖等能力在内的功能旺盛活跃。目前已有的间充质干细胞主要包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，研究结果显示它们具有较好的促进损伤修复及疾病预防、治疗前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞。提供所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是本专利技术的另一专利技术目的。本专利技术的目的还在于提供所述新的间充质干细胞的应用。一种有趣的临床现象给专利技术人提供了新的重要提示：绝经前女性的心血管事件发生率明显低于同年龄段的男性，但女性这种发病率低的优势会在绝经后丧失。现有研究结果显示，虽然绝经前后女性激素水平发生巨大变化，但单纯补充激素治疗并不能明显遏制绝经后女性心血管事件发生率增加的态势。另一方面，子宫内膜具有超强的再生能力，其功能层会发生周期性增殖、分泌和脱落，即绝经前女性所具有的生理期周期性变化。以上现象均提示，人体子宫中具有再生能力很强的干细胞。在绝经前女性、绝经后女性以及男性三种人群中均具有骨髓及脂肪等其他来源的间充质干细胞，而导致上述这种发病率差异的原因，很可能是三种人群中是否具有子宫中再生能力很强的干细胞，同时预示子宫中的这种干细胞具有很强的损伤修复功能。专利技术人在前期的小鼠研究中已经观察到，小鼠心梗后，有子宫来源的细胞归巢到心脏缺血损伤局部，参与血管新生及缺血损伤修复，并进而改善缺血心脏的心功能。因此，在人体子宫中是否也存在具有强的修复再生能力的干细胞，以及如何分离、培养出人体子宫中这种强的修复再生能力的干细胞，并将其用于预防和临床治疗领域，是一项非常具有临床应用前景及挑战性的工作。首先，本专利技术提出了一种新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞，该子宫内膜组织来源的间充质干细胞能够从人的子宫内膜组织中分离得到。其次，本专利技术提供了一种所述新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液后，直接接种于间充质干细胞培养基中进行培养及传代纯化，最终获得了上述新的具有强修复再生能力的间充质干细胞。具体地，本专利技术所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法是按照下述步骤进行的。1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/mlDNaseI的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液。2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块。3）在所述细胞团块中加入10vol%FBS-DMEM/F12培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。进而，本专利技术还提供了另外一种所述新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液后，采用密度梯度离心法分离得到包含有间充质干细胞在内的细胞群，接种于间充质干细胞培养基中，经培养及传代纯化，最终获得了上述新的具有强修复再生能力的间充质干细胞。具体地，本专利技术所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法是按照下述步骤进行的。1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/mlDNaseI的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液。2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块。3）分别配制密度为1.048～1.052g/ml，1.058～1.062g/ml，1.070～1.084g/ml的三种含有Percoll和Ads的梯度密度缓冲液，分别记为A液、B液和C液，其中B液以0.01g/l酚红标识。4）在加有A液的离心管中移入等体积的B液，轻轻插入离心管底部缓慢滴加在A液下方，形成两层液体分离的界面。5）用与A液等体积的C液重悬步骤2）获得的细胞团块，得到细胞悬液，将所述细胞悬液插入离心管底部缓慢加入在B液下方，形成具有无色-红色-无色三层液体清晰分离界面的梯度密度缓冲液。6）以1300～1700r/min离心，将细胞分散在梯度密度缓冲液的不同密度区域，吸取B液下方和C液上方区域的细胞悬液，放入预先加入15～30ml10vol%FBS-DMEM/F12的离心管中，轻柔混匀。7）1000～1300r/min离心获得细胞团块，加入10～20ml10vol%FBS-DMEM/F12，轻柔混匀，1000～1300r/min离心并收集细胞团块。8）以10vol%FBS-DMEM/F12培养基重悬细胞团块，接种于培养瓶或培养皿中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。本专利技术上述任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养过程中，除指定温度外，其余操作均在室温下进行。本专利技术上述任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法中，所使用的人子宫内膜组织是以PBS清洗干净，并充分切碎的组织。其中，任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法中，是将所述人子宫内膜组织以所述消化液消化不少于2次，并合并消化得到的细胞悬液。本专利技术分离、培养、纯化获取的人子宫内膜间充质干细胞具有很强的增殖能力及迁移分化能力，可以作为制备预防或治疗包括心梗、脑梗、糖尿病肢体远端缺血等在内的缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、其他年龄相关的退行性疾病的药物得到应用，也可以用于制备包括医学美容、亚健康人群保健、老年个体年轻化等方面的产品。体外细胞实验证明，通过上述体外分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有强增殖能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞，所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞从人的子宫内膜组织中分离得到。

【技术特征摘要】
1.一种具有强增殖能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞，所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞从人的子宫内膜组织中分离得到。2.权利要求1所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液，直接接种于间充质干细胞培养基中进行培养及传代纯化，获得所述间充质干细胞。3.根据权利要求2所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是按照下述步骤进行：1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/mlDNaseI的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液；2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块；3）在所述细胞团块中加入10vol%FBS-DMEM/F12培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。4.权利要求1所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液，采用密度梯度离心法分离得到包含有间充质干细胞的细胞群，接种于间充质干细胞培养基中，进行培养及传代纯化，获得所述间充质干细胞。5.根据权利要求4所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是按照下述步骤进行：1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/mlDNaseI的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液；2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细...

【专利技术属性】
技术研发人员：解军，李仁科，范雪梅，宋慧芳，何生，平毅，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14