一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，所述方法通过滑膜间充质干细胞的分离与培养、滑膜间充质干细胞的鉴定、软组织的培养与分离、软骨分化能力检测四个步骤简单有效地制造出软组织并对软骨分化能力进行检测，从而达到有效修复软骨的目的。其优点在于：(1)本发明专利技术所构建的软组织具有良好的软骨分化能力，可为软骨修复提供新的选择；(2)取样方便，易于检测，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，是一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用。
技术介绍
关节软骨缺损是临床上较为常见的一类疾病，主要表现为顽固性疼痛和进行性关节功能减退，若不及时根治最终会引起退行性骨关节炎。随着全国乃至全球老龄化的进程，这类疾病无疑会给家庭以及社会带来长期沉重的负担。关节软骨是关节表面上的一层致密的结缔组织，主要由软骨基质及软骨细胞构成，缺乏血管、淋巴及神经组织，因此软骨细胞代谢活性较低。此外，虽然软骨细胞具有一定的再生能力，但软骨细胞数量很少(仅占软骨组织的5％左右)，同时其周围高密度的软骨基质直接阻碍了软骨细胞向缺损区的移行，因此软骨一旦损伤发生病变后，其自愈能力极为有限。目前临床上关于关节软骨损伤的治疗主要采用手术治疗以及软骨移植术，但手术治疗只能延缓软骨损伤的进展，无法达到修复软骨损伤的目的。软骨移植术虽然具有一定的治疗效果，但软骨来源有限，难以应用于大面积的软骨损伤修复。近年来组织工程技术发展迅速，为软骨修复提供了一种潜在可行的方法，已成为新一代软骨修复技术的研究核心。间充质干细胞是一类具有自我更本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2...

【技术特征摘要】
1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2×106/ml左右，取100μl待测细胞悬液，加入抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于12孔板中，1.2*106/孔，用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养，2-3天更换一次培养液，10-14天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色；(4)软骨分化...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春辉，王刚，吕琦，易诚青，腾松松，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31