一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，所述方法通过滑膜间充质干细胞的分离与培养、滑膜间充质干细胞的鉴定、软组织的培养与分离、软骨分化能力检测四个步骤简单有效地制造出软组织并对软骨分化能力进行检测，从而达到有效修复软骨的目的。其优点在于：(1)本发明专利技术所构建的软组织具有良好的软骨分化能力，可为软骨修复提供新的选择；(2)取样方便，易于检测，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，是一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用。
技术介绍
关节软骨缺损是临床上较为常见的一类疾病，主要表现为顽固性疼痛和进行性关节功能减退，若不及时根治最终会引起退行性骨关节炎。随着全国乃至全球老龄化的进程，这类疾病无疑会给家庭以及社会带来长期沉重的负担。关节软骨是关节表面上的一层致密的结缔组织，主要由软骨基质及软骨细胞构成，缺乏血管、淋巴及神经组织，因此软骨细胞代谢活性较低。此外，虽然软骨细胞具有一定的再生能力，但软骨细胞数量很少(仅占软骨组织的5％左右)，同时其周围高密度的软骨基质直接阻碍了软骨细胞向缺损区的移行，因此软骨一旦损伤发生病变后，其自愈能力极为有限。目前临床上关于关节软骨损伤的治疗主要采用手术治疗以及软骨移植术，但手术治疗只能延缓软骨损伤的进展，无法达到修复软骨损伤的目的。软骨移植术虽然具有一定的治疗效果，但软骨来源有限，难以应用于大面积的软骨损伤修复。近年来组织工程技术发展迅速，为软骨修复提供了一种潜在可行的方法，已成为新一代软骨修复技术的研究核心。间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，目前已从骨髓、滑膜、骨膜和脂肪等多种不同的组织中分离纯化出间充质干细胞，是组织工程技术重要的种子细胞。近年来的研究发现，滑膜来源的间充质干细胞比其他来源间充质干细胞有更强的成软骨潜能。此外，滑膜位于关节囊的内层衬里，位置特殊，易于取材，并且不会影响到关节承重区。若种子细胞取材于骨髓或骨膜，将不可避免地影响骨与关节的力的承载面。因此，滑膜组织中的间充质干细胞正逐渐成为软骨组织工程的理想来源。但目前关于滑膜间充质干细胞在软骨修复中的研究非常有限，主要包括滑膜间充质干细胞的关节腔内注射以及滑膜间充质干细胞与三维支架的结合。细胞液的直接注射操作简单，但细胞易流散，导致修复区的有效干细胞数大幅减少，并且需要多次注射，软骨修复缓慢。滑膜间充质干细胞与三维支架的结合虽然在目前的临床研究取得了一定的成效，但这些支架材料的长期安全性尚属未知。基于上述两种方法的不足，一种脱离支架同时又可保证细胞形成合力避免其流散于关节腔的软组织培养技术将会在软骨损伤修复中具有更大的优势。中国专利申请：CN105392489A公开了一种软骨损伤治疗剂及其制造方法，软骨损伤治疗剂的制造方法包含以下工序:在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中，使间充质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。但是关于本专利技术一种用于修复软骨损伤的试剂及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法。本专利技术的第二个的目的是针对现有技术的不足，提供一种滑膜间充质干细胞的软组织。本专利技术的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于修复软骨损伤的试剂。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2×106/ml左右，取100μl待测细胞悬液，加入抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于12孔板中，1.2*106/孔，用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养，2-3天更换一次培养液，10-14天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色；(4)软骨分化能力检测：将软组织置于12孔板内，使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁，然后更换培养基为软骨培养基，置于培养箱中培养，隔几天更换一次培养液，培养结束后，利用RNA试剂盒提取纯化RNA，而后反转录，最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的说明操作，并用荧光定量PCR仪检测ColII、SOX9以及AGN的表达。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述乙醇是浓度为75％的乙醇。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述低糖DMEM培养液包括含10％FBS的低糖DMEM培养液和含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述多聚甲醛是浓度为4％的多聚甲醛。作为本专利技术的一个优选实施方案，步骤(1)中用乙醇消毒次数为2次，PBS缓冲液洗涤次数为2次；摇床振荡时间为2h；培养箱是37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱。作为本专利技术的一个优选实施方案，步骤(4)中置于培养箱中培养的时间为2周，每3天更换一次培养液。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织；所述标本是人新鲜滑膜标本。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上任一所述方法制备得到滑膜间充质干细胞的软组织。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于制备软骨组织的试剂，所述试剂包括：乙醇、PBS缓冲液、II型胶原酶、低糖DMEM培养液、抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体、多聚甲醛。本专利技术优点在于：1、本专利技术所构建的软组织具有良好的软骨分化能力，可为软骨修复提供新的选择。2、本专利技术间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织，其间充质干细胞比其他来源间充质干细胞有更强的成软骨潜能；此外，滑膜位于关节囊的内层衬里，位置特殊，易于取材，并且不会影响到关节承重区。3、本专利技术是一种脱离支架同时又可保证细胞形成合力避免其流散于关节腔的软组织培养的方法，在软骨修复中具有更大的优势，具有很好的应用前景。附图说明附图1是滑膜间充质干细胞的形态。图1A显示，培养初期大量细胞从组织碎片中爬出来，细胞主要为长纤状，个别细胞为类圆形。图1B显示，培养5天时，细胞融合达到了80％左右。附图2是进行滑膜间充质干细胞的鉴定，细胞表面抗原的表达情况。附图3是进行软组织的培养与分离时，将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、计数、接种、培养、吹打后的图片。图3A是将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、计数、接种、培养后的图片；图3B是将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、计数、接种、培养后，用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打，细胞层直接从培养皿底部脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2×106/ml左右，取100μl待测细胞悬液，加入抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于12孔板中，1.2*106/孔，用含有0.3mMAsc‑2P的低糖DMEM培养液培养，2‑3天更换一次培养液，10‑14天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色；(4)软骨分化能力检测：将软组织置于12孔板内，使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁，然后更换培养基为软骨培养基，置于培养箱中培养，隔几天更换一次培养液，培养结束后，利用RNA试剂盒提取纯化RNA，而后反转录，最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的说明操作，并用荧光定量PCR仪检测ColII、SOX9以及AGN的表达。...

【技术特征摘要】
1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2×106/ml左右，取100μl待测细胞悬液，加入抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于12孔板中，1.2*106/孔，用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养，2-3天更换一次培养液，10-14天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色；(4)软骨分化...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春辉，王刚，吕琦，易诚青，腾松松，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31