一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法技术

本发明专利技术公开了一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法。本方法同时可得到只含有一个N乙酰葡糖糖胺以及含有一个N乙酰葡萄糖胺加核心岩藻糖的修饰，即HN结果以及CF结果。同时按照以上数据处理方法，即根据保留时间相近、质量数差异一个岩藻糖残基的特征，利用HN修饰肽段的鉴定结果，推测相近RT时间内CF的结果，反之亦然，基于上述成对数据，可计算获得位点特异性CF修饰的比值，得到定量结果。

【技术实现步骤摘要】
一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法
本专利技术涉及一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法。
技术介绍
蛋白质核心岩藻糖基化修饰(CoreFucosylation,CF)是一种特殊的N-连接糖基化修饰。核心岩藻糖基化的改变是恶性肿瘤发生发展过程中重要的特征之一。对于蛋白质核心岩藻糖基化修饰鉴定的文章屡见不鲜，但是这些报道对于核心岩藻糖基化修饰的研究都是停留在定性鉴定方面，对于核心岩藻糖修饰位点特异性占有率的定量研究，仍然存在很大的挑战和发展空间。曾有报道一种鉴定和定量核心岩藻糖基化修饰的方法，该方法是将不同的凝集素(LCA，PSA，AAL，LTL，UEAI和AOL)与商业化的MAX柱进行单一的或串联的结合，再将富集纯化得到的含有CF修饰的肽段使用同位素辅助多重定量试剂(TMT)进行标记，运用液质联用进行检测，并用GPQeust软件进行数据分析处理，在前列腺癌样本中鉴定到252个核心岩藻糖基化修饰蛋白并定量了973个核心岩藻糖基化修饰的糖肽。但该方法存在以下不足：1)采用凝集素富集含核心岩藻糖修饰的糖肽，丢失了非核心岩藻糖修饰糖肽，从而无法实现位点特异的核心岩藻糖基化修饰占有率定量分析；2)TMT等标记试剂价格昂贵，一次最多只能标记10例样本，无法满足大规模样本的分析；3)实验操作时间较长，重复性不佳。4)从完整糖肽的水平进行质谱分析困难极大，这是由于糖链结构复杂，且糖肽质量数较高，一般质谱方法无法得到完整详细的糖肽谱图；5)糖基化修饰的微不均一性和结构异质性使得谱图的解析和数据处理带来挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法。本专利技术要求保护一种内切糖苷酶在蛋白质核心岩藻糖化修饰鉴定和/或测定位点占有率中的应用。上述应用中，所述内切糖苷酶为EndoH和/或EndoF3；所述内切糖苷酶EndoH的酶切范围为pH5.0-6.0；所述内切糖苷酶EndoF3的酶切范围为pH4.0-5.0；适用的蛋白质糖基化修饰类型为N-连接糖基化修饰。本专利技术还要求保护一种蛋白质核心岩藻糖化修饰鉴定与位点占有率大规模定量的方法，该方法包括如下步骤：1)从待测样品中分离得到糖肽混合物，再用内切糖苷酶进行酶切，将糖肽糖链部分的外围天线全部切除，剩余产物为连接有一个最内侧GlcNAc的肽段和连接有一个最内侧的GlcNAc+Fuc的肽段的混合物，记为简化糖肽样本；所述GlcNAc记为HN；所述GlcNAc+Fuc记为CF；所述连接有GlcNAc的肽段记为HN肽段；所述连接有GlcNAc+Fuc的肽段记为CF的肽段；2)采用色谱-质谱联用方法对步骤1)所得简化糖肽样本进行检测，得到质谱源文件；3)将步骤2)所得质谱源文件进行谱图筛选，得到所述CF的肽段和所述HN肽段的谱图，再对CF上述谱图进行定性分析，得到所述简化糖肽的定性结果及scannumber；所述谱图筛选的规则包括：先提取所述步骤2)所得质谱源文件中含有糖特征碎片的信号离子的谱图，再筛查所得谱图中是否核心岩藻糖特征的中性丢失母离子；若筛查到谱图中含有核心岩藻糖特征的中性丢失母离子，则对谱图进行母离子重校正并删除糖特征碎片离子峰；所述母离子重校正所用公式如下：重校正后的母离子质量＝原始母离子质量-核心岩藻糖质量；所述母离子重校正包括：将原始母离子峰的质量数减去一个核心岩藻糖的质量数；所述删除糖特征碎片离子峰步骤中，删除的糖特征碎片离子峰对应的质量数为126、138、168、186和204；所述符合N-糖基化特征序列为(NX(S/T/C)，X不为P)；X代表不为P的氨基酸；所述scannumber为谱图鉴定序列号；4)根据步骤3)所得scannumber，在步骤2)所得质谱源文件进行匹配，得到同一位点上HN肽段或CF的肽段的RT值和理论质量数；并根据质量差和保留时间差的规则，利用已获得的HN肽段或CF的肽段的RT值和理论质量数去推测同一位点上CF的肽段或HN肽段的RT值和理论质量数；所述质量差规则为HN肽段和CF的肽段的质量数相差一个核心岩藻糖的质量数；所述保留时间差的规则为HN肽段和CF的肽段的保留时间差在1min内；5)根据步骤4)所得两类简化糖肽的RT值和理论质量数，在MS1文件中提取对应的MS1峰面积，再根据公式：CF的MS1峰面积除以HN的MS1峰面积与CF的MS1峰面积之和，得到特定糖基化位点上核心岩藻糖基化修饰的位点占有率；所述名为MS1文件按照包括如下步骤的方法生成：将步骤2)所得质谱源文件中一级质谱图的所有信息进行提取而得；所述所有信息包括：所有一级母离子的精确质量数、保留时间和峰面积。上述方法的步骤1)中，所述糖肽混合物按照如下步骤制得：对蛋白质混合物进行酶切，得到肽段混合物，再进行糖肽混合物的富集；具体的，所述蛋白质混合物可为从离体的细胞、组织、尿液或血清等生物样品中提取而得；从细胞、组织中提取蛋白混合物的方法具体可为：利用细胞裂解液将细胞或组织混悬后，冰上超声提取蛋白混合物；从尿液中提取蛋白混合物的方法为丙酮沉淀法；从酵母细胞中提取蛋白质混合物的方法为玻璃珠法；所述酶切步骤中，酶切方法为FASP酶切、溶液酶切或胶内酶切方式；酶切所用酶选自Trypsin、GluC、chymotrypsin和Lys-C中至少一种；所述Trypsin的反应条件包括：50mMNH4HCO3、pH7.8；所述GluC的反应条件包括：pH4.0-9.0；所述chymotrypsin的反应条件包括：pH7.0-9.0；所述Lys-C的反应条件包括pH7.0-9.0。所述酶切步骤包括：将提取的蛋白混合物缓冲液用8MUA(pH8.0-8.5)替换变性，分批次加入50mMDTT(37度)和20mMIAA(室温)进行还原烷基化，再用pH8.0、50mMNH4HCO3替换缓冲液，最后按照比例(酶：蛋白＝1：50)加入相应的酶，37度恒温过夜所述内切糖苷酶为EndoH和/或EndoF3；所述内切糖苷酶EndoH的酶切范围为pH5.0-6.0；所述内切糖苷酶EndoF3的酶切范围为pH4.0-5.0。所述富集步骤中，富集方法为常规方法，具体可为采用亲水相互作用色谱(Hydrophilicinterationliquidchromatography,HILIC)富集；具体为一步HILIC；具体条件如下：称取5mgHILIC填料于离心管，加入适量体积0.1％TFA，放置于混悬仪上慢速摇动15min后取下离心管，在掌上离心机上短暂离心，用移液枪吸除上层液体(避免吸入下层HILIC填料)，再加入BBH(80：20：0.2＝乙腈：双蒸水：TFA)，放置于混悬仪上慢摇15min，并重复此步骤3次；将用BBH复溶的酶切样品用移液枪转移至含有填料的离心管中，放置于混悬仪上慢速摇动2h，让填料与样品充分结合；将悬浮有HILIC填料的混合液利用移液枪加入到填有C8筛板的枪头中，利用注射器将上层溶液打下，从而使糖肽保留在HILIC小柱上；加入BBH的溶液清洗HILIC上非特异性吸附的非极性肽段，重复2次；再用0.1％TFA洗脱糖肽2次，合并热干。所述步骤2)中，在所述检测步骤之前，对所述简化糖肽样本进行如下预处理：热干脱盐，再用甲酸的水溶液复溶；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.内切糖苷酶在蛋白质核心岩藻糖化修饰鉴定和/或测定位点占有率中的应用。

【技术特征摘要】
1.内切糖苷酶在蛋白质核心岩藻糖化修饰鉴定和/或测定位点占有率中的应用。2.一种色谱质谱联用方法检测蛋白质核心岩藻糖化修饰的样品前处理方法，包括：从待测样品中分离得到糖肽混合物，再用内切糖苷酶进行酶切，将糖肽糖链部分的外围天线全部切除，剩余产物为连接有一个最内侧GlcNAc的肽段和连接有一个最内侧的GlcNAc+Fuc的肽段的混合物；所述GlcNAc记为HN；所述GlcNAc+Fuc记为CF。3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的样品前处理方法，其特征在于：所述内切糖苷酶为EndoH和/或EndoF3；所述内切糖苷酶EndoH的酶切pH值为5.0-6.0；所述内切糖苷酶EndoF3的酶切pH值为4.0-5.0；适用的蛋白质糖基化修饰类型为N-连接糖基化修饰。4.一种蛋白质核心岩藻糖化修饰鉴定与位点占有率大规模定量的方法，包括如下步骤：1)从待测样品中分离得到糖肽混合物，再用内切糖苷酶进行酶切，将糖肽糖链部分的外围天线全部切除，剩余产物为连接有一个最内侧GlcNAc的肽段和连接有一个最内侧的GlcNAc+Fuc的肽段的混合物，记为简化糖肽样本；所述GlcNAc记为HN；所述GlcNAc+Fuc记为CF；所述连接有GlcNAc的肽段记为HN肽段；所述连接有GlcNAc+Fuc的肽段记为CF的肽段；2)采用色谱-质谱联用方法对步骤1)所得简化糖肽样本进行检测，得到质谱源文件；3)将步骤2)所得质谱源文件进行谱图筛选，得到所述CF的肽段和所述HN肽段的谱图，再对所述CF的肽段的谱图进行定性分析，得到所述简化糖肽的定性结果及scannumber；所述谱图筛选的规则包括：先提取所述步骤2)所得质谱源文件中含有糖特征碎片的信号离子的谱图，再筛查所得谱图中是否核心岩藻糖特征的中性丢失母离子；若筛查到谱图中含有核心岩藻糖特征的中性丢失母离子，则对谱图进行母离子重校正并删除糖特征碎片离子峰；所述母离子重校正所用公式如下：重校正后的母离子质量＝原始母离子质量-核心岩藻糖质量；所述母离子重校正包括：将原始母离子峰的质量数减去一个核心岩藻糖的质量数；所述删除糖特征碎片离子峰步骤中，删除的糖特征碎片离子峰对应的质量数为126、138、168、186和204；所述符合N-糖基化特征序列为NX(S/T/C)，X不为P；所述scannumber为谱图鉴定序列号；4)根据步骤3)所得scannumber，在步骤2)所得质谱源文件进行匹配，得到同一位点上HN肽段或CF的肽段的RT值和理论质量数；并根据质量差和保留时间差的规则，利用已获得的HN肽段或CF的肽段的RT值和理论质量数去推测同一位点上CF的肽段或HN肽段的RT值和理论质量数；所述质量差规则为HN肽段和CF的肽段的质量数相差一个核心岩藻糖的质量数；所述保留时间差的规则为HN肽段和CF的肽段的保留时间差在1min内；5)根据步骤4)所得两类...

【专利技术属性】
技术研发人员：应万涛，钱小红，黄怡，赵新元，孙亚囝，于子翔，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11