含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因的重组载体及表达、分离纯化和活性测定的方法：1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，用以作为对照；2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊25羟基维生素D‑1α羟化酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET‑28a，获得重组载体。含驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因的菌株表达获得酶的催化活性是羊的20倍，是狍子的5倍。

【技术实现步骤摘要】
含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。
技术介绍
NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochromeP450reductase，CPR)是一种以FAD和FMN作为辅基的细胞微粒体复合黄素蛋白，可以催化氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C(见附图1)，在人体主要分布于肝脏，分子量约78KD，是肝微粒体混合功能氧化酶-细胞色素P450酶系的重要组分。细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450，简称CYP450)代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。因其在内源性(如类固醇、类花生酸物质和脂肪酸)和外源性的化学物质(包括药物、植物毒素、致癌物质和环境污染物等)尤其在昆虫对杀虫剂的抗性机制以及选择毒性中，昆虫对寄主植物的适应性等方面和环境有害化学物质的氧化代谢方面起着重要的作用，而受到广泛的重视。此外，推测它能导致本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法如下：1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，用以作为对照；2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊NADPH‑细胞色素P450还原酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET‑28a，获得重组载体。

【技术特征摘要】
1.含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法如下：1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH-细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH-细胞色素P450还原酶基因序列，用以作为对照；2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊NADPH-细胞色素P450还原酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET-28a，获得重组载体。2.含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体的编码蛋白表达、分离纯化方法，其特征在于，将重组载体分别转化入大肠杆菌高效表达菌株BL21中，在2YT培养基中培养，经过IPTG诱导表达，获得菌体，收集菌体，高压破碎，之后过镍离子柱纯化，得到NADPH-细胞色素P450还原酶蛋白。3.根据权利要2所述含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，转化操作具体为：提取阳性克隆质粒200ng，与50μL商业大肠杆菌感受态BL21混合均匀，冰上孵育30min，然后42℃热击45S，再在冰上放置2min，然后加入300uL的LB培养基，37℃复苏1h，后涂布于有卡那霉素抗性的LB固体平板培养基中，过夜培养，挑取单克隆验证，阳性克隆留取备用。4.根据权利要2所述含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：1)种子液培养：挑取包含目的质粒的BL21菌株，接种于含5mLLB液体培养基的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液；2)转接：将种子液按1％接种量转入800mL2Y...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贤情，杨月，林泽山，王筱，夏文豪，蒿飞，
申请(专利权)人：嘉兴欣贝莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33