用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物及其应用与使用方法技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物及其应用与使用方法。本发明专利技术通过设计合成的3条2对引物，通过对SLCO1B3基因进行多重PCR扩增，观察该基因是否插入了EAV‑HP序列的由引物1和引物2组成的引物组合物，并且可以通过检测扩增产物来鉴定待测鸡的SLCO1B3基因的基因型。通过这样的方式能准确的鉴别绿壳蛋鸡及其基因型，SLCO1B3基因插入序列基因型SL/SL能够作为产绿壳蛋的有效分子遗传标记。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物及其应用与使用方法
本专利技术涉及饮品生物
，尤其是一种用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物及其应用与使用方法。
技术介绍
蛋壳颜色是评价鸡蛋品质的一个重要指标，消费者对于蛋壳颜色也有着一定的偏好，人们通常认为鸡蛋蛋壳颜色越深，则鸡蛋品质越优良。研究表明：绿壳蛋相对于非绿壳蛋具有较高的蛋白质含量，且人体必需氨基酸及鲜味氨基酸含量均高于非绿壳蛋；绿壳蛋相对于非绿壳蛋具有较低的脂肪酸含量，同时不饱和脂肪酸含量高于非绿壳蛋；因为绿壳蛋中含有较多胆绿素，使得绿壳蛋的蛋黄也要显著大于非绿壳蛋，而较大的蛋黄中则含有较多的抗氧化物及营养物质；绿壳蛋中VA、胆固醇、磷、钾含量显著高于非绿壳蛋，说明绿壳蛋较非绿壳蛋维生素及矿物质含量丰富。因此培育蛋壳颜色美观、色泽均一、遗传稳定的品种成为了家禽育种的目标之一，并且具有良好的市场前景。绿壳蛋形成的分子机制是：内源性逆转录病毒EAV-HP元件以反向插入的方式，整合在溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B3基因的5’－非编码区，从而启动了绿壳基因(SLCO1B3)在卵壳腺中的特异性高表达。同时，鸡绿壳蛋性状是由显性单基因控制的质量性状，即纯合绿壳蛋鸡与纯合非绿壳蛋鸡或杂合绿壳蛋鸡杂交，F1代总是下绿壳蛋，这种遗传特点使得很难通过表型选育将非绿壳等位基因彻底淘汰；采用一些和绿壳性状显著关联的分子标记进行辅助选择，可以在一定程度上提高选种的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物及其应用与使用方法，它能准确的鉴别绿壳蛋鸡及其基因型，SLCO1B3基因插入序列基因型SL/SL能够作为产绿壳蛋的有效分子遗传标记。本专利技术是这样实现的：用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物，包括2对共3条引物，包含1条上游引物F，1条下游引物R1，1条下游引物R2，上游引物F及下游引物R1为SLCO1B3基因EAV-HP序列插入引物,上游引物F与下游引物R2为SLCO1B3基因非插入序列引物，其中，上游引物F的引物序列为：5'GGCAGAGGGTTGATCCAAAGTA3'，下游引物R1的引物序列为：5'GTGAGCAAGTCCCACCTATTCG3'；下游引物R2的引物序列为:5'ATAGAGACAAAACCACAAAGGTAATG3'。所述的引物在鉴别赤水乌骨鸡绿壳基因型中的应用。所述的引物来鉴别赤水乌骨鸡绿壳基因型的方法，以待检测鸡的DNA基因组为模板，用引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果：若只得到884bp的条带，则待检测鸡的SLCO1B3基因基因型为SL/SL绿壳纯合型；若只得到732bp的条带，则待检测鸡的SLCO1B3基因基因型为W/W非绿壳纯合型；若得到884bp及732bp的两条带，则待检测鸡的SLCO1B3基因基因型为SL/W杂合型。所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，51.3℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存。反应体系：上游引物F加2μL，下游引物R1加2μL；下游引物R2加2μl，2×PCRTaqmix为15μL，ddH2O加7μL，模板DNA加2μL，总反应为30μL体系。多重PCR技术(multiplexPolymeraseChainReaction)，一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。因此，多重PCR技术具有操作简单、特异性强、灵敏度高、DNA模板要求低等特点，适用于快速鉴别赤水乌骨鸡绿壳基因型。本专利技术通过设计合成的3条2对引物用于多重PCR扩增，对SLCO1B3基因进行扩增，观察该基因是否插入了EAV-HP序列的由上游引物与引物组成的引物组合物。可以通过检测扩增产物来鉴定待测鸡的SLCO1B3基因的基因型。通过这样的方式能准确的鉴别绿壳蛋鸡及其基因型，SLCO1B3基因插入序列基因型SL/SL能够作为产绿壳蛋的有效分子遗传标记。附图说明图1为SLCO1B3基因插入EAV-HP测序图；图2为SLCO1B3基因非插入EAV-HP测序图；图3为SLCO1B3基因EAV-HP插入序列的三种基因型琼脂糖电泳图；图4为SLCO1B3基因EAV-HP元件插入序列与公布序列对比。具体实施方式本专利技术的实施例1：以包含SLCO1B3基因的待测鸡全基因组DNA为模板，设计特异性的引物对赤水乌骨鸡SLCO1B3基因及EAV-HP插入片段序列进行扩增，将扩增产物直接在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，电泳完毕后采用凝胶成像系统拍照，对个体基因型进行判定。具体实施方法：(1)特异性引物的设计：以NCBI公布的SLCO1B3基因序列(NC_006088.4)及文献《EndogenousRetrovirusEAV-HPLinkedtoBlueEggPhenotypeinMapucheFowl》中公布序列做为参考，利用Primer6.0设计PCR引物。SLCO1B3基因EAV-HP插入片段扩增序列为：上游引物F：5'GGCAGAGGGTTGATCCAAAGTA3'(序列表中的序列1)下游引物R1：5'GTGAGCAAGTCCCACCTATTCG3'(序列表中的序列2)其扩增片段长度为884bp；SLCO1B3基因非插入片段扩增序列为：上游引物F：5'GGCAGAGGGTTGATCCAAAGTA3'(序列表中的序列1)下游引物R2:5'ATAGAGACAAAACCACAAAGGTAATG3'(序列表中的序列3)其扩增片段长度为732bp。(2)鸡样本的采集：以1309只赤水乌骨鸡作为检测对象。表1实验材料表1：(3)鸡血样基因组DNA的提取①将冷冻血液置于室温融化，取10μl移至1.5ml离心管中，加入500μlSTE缓冲液，10μlSDS，加入10μl蛋白酶K(浓度为10μg/μl)，充分混合后，置于37℃恒温水浴摇床2h，后再55℃水浴过夜。②将溶液置于室温冷却，加入等体积的苯酚，轻摇离心管20min，直至形成均匀的乳浊液，然后置于12000r/min4℃冷冻离心10min。③取上清液，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10min，置于12000r/min4℃冷冻离心10min。④制备酚：氯仿：异戊醇混合液(24：:2:1)。⑤取③中上清液，加入酚、氯仿、异戊醇混合液，缓慢颠倒离心管10min，置于12000r/min4℃冷冻离心10min。⑥取上清液，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10min，置于12000r/min4℃冷冻离心10min。⑦取上清液，加入2倍体积的预冷-20℃冰乙醇，缓慢的摇动离心管，可见白色DNA沉淀。⑧置于12000r/min4℃冷冻离心10min，去除上清液，然后加4℃预冷的乙醇快速冲洗2次，置于12000r/min4℃冷冻离心10min后，去除上清液。⑨将带DNA沉淀的离心管倒置在干净的纸巾上，待自然干燥后，根据DNA沉淀的量加入适量(50-100μl)TE(pH8.0)缓冲液溶解，置于4℃冰箱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物，其特征在于：包括2对共3条引物，包含1条上游引物F，1条下游引物R1，1条下游引物R2，上游引物F及下游引物R1为SLCO1B3基因EAV‑HP序列插入引物,上游引物F与下游引物R2为SLCO1B3基因非插入序列引物，其中，上游引物F的引物序列为：5’GGCAGAGGGTTGATCCAAAGTA 3’，下游引物R1的引物序列为：5’GTGAGCAAGTCCCACCTATTCG 3’；下游引物R2的引物序列为:5’ATAGAGACAAAACCACAAAGGTAATG 3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定赤水乌骨鸡绿壳基因型的引物，其特征在于：包括2对共3条引物，包含1条上游引物F，1条下游引物R1，1条下游引物R2，上游引物F及下游引物R1为SLCO1B3基因EAV-HP序列插入引物,上游引物F与下游引物R2为SLCO1B3基因非插入序列引物，其中，上游引物F的引物序列为：5’GGCAGAGGGTTGATCCAAAGTA3’，下游引物R1的引物序列为：5’GTGAGCAAGTCCCACCTATTCG3’；下游引物R2的引物序列为:5’ATAGAGACAAAACCACAAAGGTAATG3’。2.一种如权利要求1所述的引物在鉴别赤水乌骨鸡绿壳基因型中的应用。3.一种采用如权利要求1所述的引物来鉴别赤水乌骨鸡绿壳基因型的方法，其特征在于：以待检测鸡的DNA基因组为模板，用引物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，陈林，赵忠海，卜小雁，师新彩，杨华婷，李兴才，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52