一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术构建的工程菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L‑氨基酸氧化酶、α‑羟基羧酸脱氢酶和L‑乳酸脱氢酶。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。该方法过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用
本专利技术涉及一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用，属于生物工程

技术介绍
4-羟基苯乳酸，又名对羟基苯乳酸，学名为3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸，英文名为：4-hydroxyphenyllacticacid、p-Hydroxyphenyllacticacid，2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoicacid。4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。有也文献表明，普通变形杆菌(Proteusvulgaris)可将L-酪氨酸转化成D-4-羟基苯乳酸(Theinfluenceofconditionsofbacterialcleavageofproteinsonthecleavageproducts,1917,J.Biol.Chem.527-532)。但这些方法产率低成本高。
技术实现思路
基于目前各种方法的缺陷，本专利技术提出了一种新型的对羟基苯乳酸的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了对羟基苯乳酸的高效生产。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产对羟基苯乳酸的重组菌，同时本专利技术要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本专利技术的第一个目的是提供能低成本生产光学纯对羟基苯乳酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于ErwiniaherbicolaATCC214344。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为P31011.2。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自LactobacillusplantarumATCC14917、EnterococcusfaecalisATCC35038或者LactobacillusfermentumATCC14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自BacilluscoagulansDSM1、WeissellaconfusastrainDSM20196或者LactobacillusfermentumATCC14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_013858488.1、WP_003607654.1或WP_035430779.1的序列。在一种实施方式中，D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为NZ_GL379761REGION:COMPLEMENT(533562..534560)、NZ_KB944641REGION:161892..162830、ACGI01000078REGION:20793..21791的序列；L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为NZ_ATUM01000014REGION:39316..40254、NZ_JQAY01000006REGION:69708..70640、NZ_GG669901REGION:45517..46470的序列。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自LactococcuslactisATCC19257。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_003131075.1序列。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509的序列。在一种实施方式中，所述L-氨基酸氧化酶为的来自ProteusmirabilisATCC29906、CosenzaeamyxofaciensATCC19692、MorganellamorganiiATCC49993、ProvidenciarettgeriDSM1131或IgnatzschinerialarvaeDSM13226中的不产过氧化氢的L-氨基酸氧化酶。在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_004244224.1、OAT30925.1、EFE55026.1、WP_036414800.1或WP_026879504.1的序列。在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：NZ_GG668576REGION:1350390..1351805、LXEN01000066REGION:20563..21963、ACCI02000030REGION:21025..22443、NZ_LAGC01000006REGION:309569..310993、NZ_KI783332REGION:35799..37217。在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和L-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶基因和L-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒pETDuet-1后表达、L-氨基酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pACYCDue-1后表达。在一种实施方式中，所述宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将EscherichiacoliBL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(苯酚转运基因)、mhpT(苯酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)、ribF(FAD合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892REGION:complement(450202本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产对羟基苯乳酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时酪氨酸酚裂解酶、L‑氨基酸氧化酶、L‑乳酸脱氢酶、α‑羟基羧酸脱氢酶，还敲除了酚类物质分解基因。

【技术特征摘要】
1.一种生产对羟基苯乳酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶，还敲除了酚类物质分解基因。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶来自于ErwiniaherbicolaATCC214344。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述α-羟基羧酸脱氢酶为来自LactobacillusplantarumATCC14917、EnterococcusfaecalisATCC35038或者LactobacillusfermentumATCC14931的D型α-羟基羧酸脱氢酶，或者来自BacilluscoagulansDSM1、WeissellaconfusastrainDSM20196或者LactobacillusfermentumATCC14931的L型α-羟基羧酸脱氢酶。4.一种生产对羟基苯乳酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任一所述的重组菌。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生产对羟基苯乳酸是利用重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，熊天真，蒋静，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32