一种工程菌及其在生产L-酪氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种工程菌及其在生产L‑酪氨酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提出了不生成氧化氢的转化乳酸和苯酚产L‑酪氨酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了三酶共表达的工程菌，实现了L‑酪氨酸的高效生产。本发明专利技术的全细胞转化生产L‑酪氨酸的方法，过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌及其在生产L-酪氨酸中的应用
本专利技术涉及一种工程菌及其在生产L-酪氨酸中的应用，属于生物工程

技术介绍
L-酪氨酸(p-hydroxyphenylalanine)是人体的必须氨基酸，在医药和食品方面具有重要的应用。目前L-酪氨酸的来提取法、酶法、基因工程菌发酵法等。从毛法等原料水解提取L-酪氨酸过程污染大且纯度较低。大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料重头合成L-酪氨酸的产率较低，目前无法与提取法及酶法竞争。以酪氨酸酚裂解酶酶法生产L-酪氨酸是最为广泛应用的方法。已有多种方案被设计(SynthesisofL-Tyrosineor3,4-Dihydroxyphenyl-L-alaninefromDL-SerineandPhenolorPyrocathechol，Agric.Biol.Chem.37(1973)493–499.中国专利201310168119.5)，其中以丙酮酸和苯酚为底物的转化方法已在工业上实施。丙酮酸是较为昂贵的一种中间体，因此专利201310289373.0采用未提纯的丙酮酸料液直接进行转化，或者先用乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸，然后再进一步催化生产L-酪氨酸(多酶偶联生物合成丙酮酸和L--酪氨酸研究，2014，南京大学硕士论文)，但丙酮酸易分解，这种方案效率并不高。
技术实现思路
基于目前各种方法的缺陷，本专利技术提出了不生成氧化氢的转化乳酸和苯酚产L-酪氨酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了三酶共表达的工程菌，实现了L-酪氨酸的高效生产。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能生产L-酪氨酸并减少杂质生成的重组菌，同时本专利技术要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本专利技术的第一个目的是提供能低成本生产纯多左旋巴的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了L-酪氨酸吸收基因。在一种实施方式中，所述外源L-乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的L-乳酸脱氢酶。外源的NADH氧化酶为乳酸菌来源的NADH氧化酶。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来自于LactococcuslactisATCC19257、LactobacillusplantarumATCC14917。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_003131075.1、KRL33571.1的序列。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509、AZEJ01000016REGION:16296..17249的序列。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自LactococcuslactisATCC19257、LactobacillussanfranciscensisDSM20451、LactobacillusbrevisATCC14869。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_032950924.1、WP_056958268.1、ERK43827.1序列。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000002REGION:complement(39571..40911)、NZ_AYYM01000013REGION:complement(15875..17233)、AWVK01000048REGION:complement(50022..51416)的序列。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶、酪氨酸酚裂解酶是通过pETDuet-1共表达的。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacterintermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)、嗜热菌Symbiobacteriumthermophilum或者Symbiobacteriumtoebii。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于CitrobacterfreundiiATCC8090，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_003837154.1的序列。在一种实施方式中，所述L-酪氨酸吸收基因包括L-酪氨酸分解基因、苯酚分解基因中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述L-酪氨酸分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述苯酚分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述L-酪氨酸分解基因和苯酚分解基因的核苷酸序列是NCBI上,NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还强化表达了将底物转运至细胞内的乳酸转运蛋白基因、苯酚转运相关基因、氨根离子转运基因中的任意一种或者多种。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还进一步强化表达了NAD合成基因、磷酸吡多醛合成相关基因中的任意一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、amtB(氨根离子转运基因)、hpaX(苯酚转运基因)、mhpT(苯酚转运基因)、icsA(NAD合成基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将EscherichiacoliBL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；amtB为NC_012892REGION:442006..443292；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；icsA为NC_012892REGION:complement(2526116..2527330)；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。本专利技术的第二个目的是提供一种生产光学纯L-酪氨酸的方法，所述方法是利用本专利技术的重组菌。在一种实施方式中，所述生产L-酪氨酸，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-乳酸1-200g/L，苯酚浓度1-200g/L，pH7.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。本专利技术的第三个目的是提供本专利技术重组菌或者本专利技术方法在化工、食品、医药等领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L‑乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了L‑酪氨酸分解相关的基因、苯酚分解相关的基因中的任意一种或者多种。

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了L-酪氨酸分解相关的基因、苯酚分解相关的基因中的任意一种或者多种。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了L-乳酸脱氢酶Llldh、NADH氧化酶llnox和酪氨酸酚裂解酶cftpl，敲除了芳香化合物降解基因hpaD和mhpB，并且强化表达了乳酸转运基因lldP、苯酚转运基因hpaX、苯酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ。3.一种生产光学纯L-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达的外源L-乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的L-乳酸脱氢酶。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除的基因为hpaD、mhpB中的任意一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，熊天真，蒋静，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32