本发明专利技术公开了一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团。本发明专利技术以人类PAX1基因甲基化突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地测PAX1基因甲基化突变，且对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
在宫颈肿瘤细胞中，PAX1基因(配对盒家族基因1)启动子发生甲基化后会造成基因沉默或失活，从而使抑癌基因PAX1失去活性，这一点已得到国际上的广泛认可。不仅如此，根据国际多项研究证实，重度癌前病变或宫颈癌患者其局部区域的配对盒家族基因1(PAX1基因)启动子区域的CpG岛(CpGisland)甲基化程度会异常升高，导致宫颈癌变现象产生，此基因高度甲基化造成细胞功能发生重大改变，因而可做为目前TCT与HPV检测结果的癌化转变监测。Lai等在2008年发现配对盒基因(Pairedbox1，PAX1)在宫颈癌中具有高甲基化表现，数年间研究已有十多篇国际文献报导。许多文献验证PAX1基因具有筛查的临床意义。同样的，Huang等在2010年发现PAX1在宫颈癌组织中具有94.4％与100％高度甲基化现象。2010年Lai研究PAX1具有78％敏感性与91％特异性；在2014年Kan文章中也验证PAX1具有86％敏感性与85％特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由PAX1-F和PAX1-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；第一检测探针为PAX1-P，包括如SEQIDNO03所示的序列；第二检测引物对由ACTB-F和ACTB-R组成，依次包括如SEQIDNO04和05所示的序列；第二检测探针为ACTB-P，包括如SEQIDNO06所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、模板和H2O；上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1。进一步优选的，所述PAX1-F如SEQIDNO01所示。进一步优选的，所述PAX1-R如SEQIDNO02所示。进一步优选的，所述PAX1-P如SEQIDNO03所示。进一步优选的，所述ACTB-F如SEQIDNO04所示。进一步优选的，所述ACTB-R如SEQIDNO05所示。进一步优选的，所述ACTB-P如SEQIDNO06所示。上述引物及探针具体序列如下表所示：引物和探针序列(5-3)PAX1-FTGTACGTTGTAGTTTTTCGGTTPAX1-RCAAAAACCGCGACGACCPAX1-PFAM-CTACCCCCTCCCAAAACACTC-BHQ1ACTB-FTGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAACTB-RCCAATAAAACCTACTCCTCCCTACTB-PHEX-CCACCACCCAACACACAATAACAAAC-BHQ1本专利技术的有益效果：本专利技术以人类PAX1基因甲基化突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地测PAX1基因甲基化突变，且对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。附图说明图1为本专利技术实施例2中检测PAX1基因甲基化突变阴性的样品检测曲线图。图2为本专利技术实施例2中检测PAX1基因甲基化突变阳性的样品检测曲线图。图3为本专利技术实施例2中的荧光PCR的反应条件图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由PAX1-F和PAX1-R组成，依次如SEQIDNO01和02所示；第一检测探针为PAX1-P，如SEQIDNO03所示；第二检测引物对由ACTB-F和ACTB-R组成，依次如SEQIDNO04和05所示；第二检测探针为ACTB-P，如SEQIDNO06所示；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、模板和H2O；上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1。上述引物及探针具体序列如下表1所示：表1本专利技术(包括下述实施例)的上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化，具体如下：1.取0.5μL修饰剂C溶液加至修饰剂A溶液中，并将溶解完全的修饰剂B溶液全部加至修饰剂A溶液中，震荡混匀，配制成修饰缓冲液，避光放置待用。2.取基因组DNA2μg，于1.5mLEP管中，并以纯化水补足体积至36μL。3.加入4μL修饰剂C溶液，置于37℃金属浴或水浴锅保温反应，静置10min；或置于室温反应15min。4.加入600μL上述新鲜配制的修饰缓冲液，置于65℃金属浴或水浴锅，避光反应2小时。5.加入600μL吸附缓冲液，轻微涡旋振荡10s，轻微离心，室温静置3min。6.加入-20℃预冷的无水乙醇300μL，轻柔颠倒混匀，静置3min，轻微离心。7.转移液体至硅胶吸附柱中，8000rpm离心30s，硅胶吸附柱每次最多可加入溶液750μL，弃去滤液，随后将剩余溶液转移至硅胶吸附柱中，8000rpm离心30s，弃去滤液。(注：为提高吸附效率，离心后可将滤液再次转移至硅胶吸附柱中，重复过柱)8.向硅胶吸附柱中加入500μL漂洗液I(使用前检查是否已加入无水乙醇，需加入10mL常温无水乙醇)，8000rpm离心30s，弃去滤液。9.向硅胶吸附本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由PAX1‑F和PAX1‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列；第一检测探针为PAX1‑P，包括如SEQ ID NO 03所示的序列；第二检测引物对由ACTB‑F和ACTB‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列；第二检测探针为ACTB‑P，包括如SEQ ID NO 06所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、模板和H2O；上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由PAX1-F和PAX1-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；第一检测探针为PAX1-P，包括如SEQIDNO03所示的序列；第二检测引物对由ACTB-F和ACTB-R组成，依次包括如SEQIDNO04和05所示的序列；第二检测探针为ACTB-P，包括如SEQIDNO06所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、模板和H2O；上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈琰，康灿昆，甘煌灿，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35
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