本发明专利技术公开了一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法及应用，属于动物分子遗传学技术领域。本发明专利技术所提供的方法是根据鸡蛋白前体加工酶1基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，最后利用PCR‑RFLP技术分析基因多态性，获得鸡腹脂标记基因型。本发明专利技术所提供的方法具有操作简单、费用低、精确度高的特点，可进行自动化检测，是一种有效的分子标记育种手段，可大幅加快鸡的育种进程。
【技术实现步骤摘要】
一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法及应用
本专利技术涉及一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法及应用，属于动物分子遗传学
技术介绍
肉鸡业在世界范围内，尤其在中国等发展中国家具有良好的发展前景。在过去的半个多世纪，在育种上依赖于表型值的选择已经取得了显著的进展，肉鸡的生长速度和肉产量得以明显提高。随着我国肉鸡业的快速发展，肉鸡的生理性不适症及相关疾病也随之增加，如体脂蓄积过多、腹水综合症、猝死症、腿部疾病、机体免疫功能下降等，这些问题给肉鸡生产者造成的经济损失是显而易见的。肉鸡体脂(尤其是腹脂)过度沉积，不仅会造成肉鸡生产过程中的浪费，提高生产成本，而且肉种母鸡过肥会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症的发生，肉种公鸡过肥会影响采精量，降低精液品质，同时过度肥胖引起的一些疾病会加大产蛋期的死淘率，降低经济效益。此外，受到消费者日渐重视饮食健康的影响，目前我国肉制品消费主要以低脂肪禽肉产品为主。近年来，随着分子遗传学的发展，遗传标记逐渐应用于畜禽的标记辅助选择育种中，此项技术可有效促进遗传选育准确性的提高。分子标记辅助选择是一种直接对影响重要经济性状的基因组区域进行选择的方法。畜禽许多数量性状不仅受微效多基因控制，而且还受单个或多个主效基因的影响。选择与数量性状位点相连锁的分子标记，即可实现对基因型的直接选择，从而极大地提高家禽育种效率、加快育种进程，为解决肉鸡腹脂蓄积过多问题提供理论依据。蛋白前体加工酶(ProproteinConvertase，PC)是一类Ca2+依赖性的丝氨酸蛋白酶家族，其主要功能是剪切无生物活性的蛋白或肽链的前体，使之变成有活性的功能分子。其中，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶1(ProproteinConvertaseSubtilisin/KexinType1，PCSK1)主要在神经以及内分泌组织中表达，该基因所编码的蛋白可以激活人体内控制食欲的胰岛素、胰高血糖素以及令人产生饱腹感的阿黑皮素原等。哺乳动物上的研究结果表明，PCSK1基因主要在神经以及内分泌组织中表达。在人上，PC1/3蛋白缺乏症是一种罕见的单基因肥胖病，主要表现为儿童肥胖、小肠吸收功能障碍以及各种内分泌紊乱。对影响人类肥胖的QTL定位结果表明，影响人类肥胖的基因位于染色体5q上，该染色体区域包含PCSK1在内的多个基因。近年来，针对人类肥胖症开展了全基因组关联分析，发现了一些肥胖相关的风险位点，其中包括PCSK1基因。PCSK1基因多态性分析结果表明，该基因上的两个位点的多态性与人类肥胖显著相关。小鼠上的研究表明，PCSK1敲除鼠会出现严重的发育异常，这是由于PCSK1缺失导致了很多神经内分泌激素的成熟过程受到了破坏。对PCSK1缺失小鼠GHRH分泌水平的检测结果发现，PCSK1缺失小鼠的GHRH前体在体内大量累积，而成熟的GHRH水平很低。在小鼠体内阻碍PCSK1基因的表达会引起胰岛素原加工的缺陷，PCSK1基因表达量的减少会引起胰腺以及循环系统中胰岛素原的增加，同时成熟的胰岛素几乎全部消失。目前为止，尚未发现有关于鸡PCSK1基因功能研究相关的报道，同时，也没有通过PCSK1基因分子标记对鸡腹部脂肪含量进行选择的方法，更没有通过其SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物进而进行分子标记方法用于筛选基因型的报道。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法，所采取的的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法，其特征在于，根据鸡PCSK1基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，最后利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)分析基因多态性，获得鸡腹脂标记基因型；所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示。所述鸡腹部脂肪量，是指鸡的腹脂重和腹脂率。所述方法的步骤如下：1)根据鸡PCSK1基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，获得扩增引物；2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；4)利用琼脂糖凝胶对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得分离产物；5)利用PCR-RFLP技术对步骤4)所得的分离产物进行基因型分析，获得鸡腹脂标记基因型。步骤1)所述引物，核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示。步骤3)所述限制性内切酶，是限制性内切酶BsrGI-HF；步骤4)所述琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶的浓度为3％。步骤5)所述基因型分析，分析的部位是鸡PCSK1基因的CDS区。优选地，所述分析的部位，分析的位点是SEQIDNO.3所示鸡PCSK1基因序列的第627个氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)的错义突变。步骤5)所述鸡腹脂标记基因型，当鸡PCSK1基因位点c.1880C>T为T碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为347bp，将其命名为TT基因型；当鸡PCSK1基因位点c.1880C>T为C碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为383bp，将其命名为CC基因型；该位点杂合的个体酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为两条，大小分别为347bp和383bp，将其命名为CT基因型。所述方法用于鸡的遗传育种。本专利技术有益效果：本专利技术证明c.1880C>T突变位点的两种基因型在高低脂双向选择系两系间的等位基因分布频率存在极显著差异(P<0.01)，且这两个位点高度连锁；在AA肉鸡随机群体中，c.1880C>T突变位点对肉鸡腹部脂肪量性状的影响达极显著水平(P<0.01)，该位点功能未见报道，更没有文献报道过该位点基因突变的各种基因型各表达为哪种特征。本专利技术操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本专利技术的分子标记方法对鸡腹部脂肪量进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹部脂肪性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。附图说明图1为PCSK1基因SNP位点c.1880C>T分析图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例1缓冲溶液配制及引物设计1.实验动物和性状测定东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第十九世代542只公鸡、第二十世代685只公鸡；AA肉鸡随机群体348只鸡。对高、低脂系肉鸡及AA肉鸡分别于7周龄时翅静脉采血，EDTA-Na2抗凝。7周龄屠宰前测定活重，屠宰后测定腹脂重，并除以7周龄活重计算出腹脂率。2.药品和酶三羟甲基氨基甲烷(Tris)，SigmaChemicalsCo；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(ProteinaseK)，MMERCKCo；DL2000，大连宝生物公司；dNTP(d本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法，其特征在于，根据鸡前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶1(PCSK1)基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，最后利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术分析基因多态性，获得鸡腹脂标记基因型；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种预示和鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法，其特征在于，根据鸡前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶1(PCSK1)基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，最后利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术分析基因多态性，获得鸡腹脂标记基因型；所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述鸡腹部脂肪量，是指鸡的腹脂重和腹脂率。3.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：1)根据鸡PCSK1基因SNP位点c.1880C>T上下游190bp序列设计引物，获得扩增引物；2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；4)利用琼脂糖凝胶对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得分离产物；5)利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术对步骤4)所得的分离产物进行基因型分析，获得鸡腹脂标记基因型。4.权利要求3所述方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，李辉，杨莉莉，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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