从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其用途，该方法先通过提取、萃取、大孔吸附树脂层析、酸解处理茶花粉，再采用高速逆流色谱（HSCCC）进一步分离，最后通过高效液相色谱、核磁共振和质谱分析确定所得化合物为对羟基肉桂酸乙酯，从而实现了从茶花粉中直接分离纯化出对羟基肉桂酸乙酯；在从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯时，具有无不可逆吸附、无样品污染和变性、回收率高、分离量大、分离效率高、操作简单和重现性好等优点。该对羟基肉桂酸乙酯可用于制备酪氨酸酶抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其应用
本专利技术涉及分离提纯
，具体涉及一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其应用。
技术介绍
茶花粉是雄性生殖细胞，是遗传基因源，担负着植物遗传的任务，具有全面的营养及多种生物学功能。其活性成分如多酚、黄酮、多糖以及脂质类物质等对茶花粉的抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节机体免疫能力等生物活性具有极其重要的作用。对羟基肉桂酸乙酯是对羟基肉桂酸的衍生物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性。目前，对羟基肉桂酸乙酯主要是通过硅胶柱、凝胶柱及制备型高效液相色谱法等手段从天然产物中分离纯化出。但是，上述的分离纯化方法存在分离时间长、易形成死吸附、会降低产物活性等缺点，因此在对羟基肉桂酸乙酯的分离纯化方面，新的替代方法越来越受关注。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即提高分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的效率、无不可逆吸附、无样品污染和变形、回收率高。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法。本专利技术的另一个目的在于提出对羟基肉桂酸乙酯作为酪氨酸酶抑制剂的用途。为达到上述目的，本专利技术第一方面实施例提出了一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其包括以下步骤：S1、提取：取粉碎的茶花粉，按料液比1g:5mL-25mL加入0%-95%的乙醇，于30℃-70℃下水浴浸提6h，共提取3次，抽滤，合并滤液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，得粗提物；S2、萃取：粗提物按料液比1g:10mL加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，按料液比1g:10mL加入蒸馏水复溶，振荡，4500r/min离心12min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，得大孔树脂30%乙醇洗脱相；S4、酸解：取大孔树脂30%乙醇洗脱相,按料液比0.1g:50mL加入无水乙醇,而后再加入等体积4M的盐酸,于90℃水浴中酸水解90min,将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30%乙醇洗脱相酸解物；S5、HSCCC制备分离：配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，采用头-尾洗脱，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，稳定后，调节转速至700rpm-900rpm，将流动相以3mL/min-6mL/min的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为30%乙醇洗脱相酸解物,同时通过紫外检测器检测流出物，紫外检测波长设置为280nm，根据峰行收集各组分；S6、组分鉴定：将步骤S5收集到的组分按顺序编号，以对羟基肉桂酸乙酯标准品作为对照，利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定某一编号对应的组分为对羟基肉桂酸乙酯。根据本专利技术实施例的一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其通过提取、萃取、大孔吸附树脂层析、酸解处理后，再利用高速逆流色谱（HSCCC）进一步分离纯化，最后通过高效液相色谱、核磁共振、质谱进行鉴定，确定所得化合物为对羟基肉桂酸乙酯，实现了从茶花粉中直接分离纯化出对羟基肉桂酸乙酯，所得到的对羟基肉桂酸乙酯纯度高、杂质少。在从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯时，具有无不可逆吸附、无样品污染和变性、回收率高、分离量大、分离效率高、操作简单和重现性好。另外，根据本专利技术上述实施例提出的一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，还可以具有如下附加的技术特征：所述步骤S1中，茶花粉与乙醇的料液比为1g:10mL。所述步骤S1中粉碎的茶花粉是经高速万能粉碎机粉碎后，过40目的筛获得。所述步骤S1中，茶花粉浸提时乙醇浓度为80%。所述步骤S1中，茶花粉水浴浸提温度为50℃。所述步骤S3中不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，其洗脱条件为：依次用浓度0%、10%、30%的乙醇水溶液进行洗脱。所述步骤S5中，转速设置为850rpm，流动相的流速控制在3mL/min。所述步骤S3中，大孔树脂采用HP-20型。本专利技术的第二方面实施例还提出对羟基肉桂酸乙酯作为酪氨酸酶抑制剂的用途，其以对羟基肉桂酸乙酯作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备酪氨酸酶抑制剂，所述对羟基肉桂酸乙酯采用如上述述的方法分离纯化出。根据本专利技术的对羟基肉桂酸乙酯作为酪氨酸酶抑制剂的用途，其通过在研究对羟基肉桂酸乙酯的作用机制的过程中，发现对羟基肉桂酸乙酯对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，而酪氨酸酶是黑色素生成过程中的重要限速酶，通过抑制该酶活性可有效减少黑色素的累积，实现美白、祛斑效果。附图说明图1为根据本专利技术实施例四乙醇浓度对对羟基肉桂酸乙酯抑制酪氨酸酶活性的影响；图2为根据本专利技术实施例四料液比对对羟基肉桂酸乙酯抑制酪氨酸酶抑制活性的影响；图3为根据本专利技术实施例四温度对对羟基肉桂酸乙酯抑制酪氨酸酶抑制活性的影响；图4为根据本专利技术实施例四转速对固定相保留率的影响；图5为根据本专利技术实施例四流速对固定相保留率的影响；图6为根据本专利技术实施例四HSCCC分离对羟基肉桂酸乙酯色谱图；图7是根据本专利技术实施例四分离的样品peakⅠ-peakⅣ的高效液相色谱图；图8是根据本专利技术实施例四对羟基肉桂酸乙酯标准品的高效液相色谱图；图9是根据本专利技术实施例四分离的样品peakⅣ的核磁谱图；图10是根据本专利技术实施例四对羟基肉桂酸乙酯标准品的核磁谱图；图11是根据本专利技术实施例四分离的样品peakⅣ的质谱图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。本专利技术提供一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其主要解决的是现有的在分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法存在着分离时间长、易形成死吸附、会降低产物活性等缺点；为了解决上述问题，该方法采用的方案是通过提取、萃取、大孔吸附树脂层析、酸解处理后，再采用高速逆流色谱（HSCCC）进一步分离，最后通过高效液相色谱、核磁共振和质谱分析,确定所纯化合物为对羟基肉桂酸乙酯，从而实现了从茶花粉中直接分离纯化出对羟基肉桂酸乙酯。实现了从茶花粉中直接分离纯化出对羟基肉桂酸乙酯，所得到的对羟基肉桂酸乙酯纯度高、杂质少。在从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯时，具有无不可逆吸附、无样品污染和变性、回收率高、分离量大、分离效率高、操作简单和重现性好。为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然附图中显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。为了更好的理解上述技术方案，下面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取：取粉碎的茶花粉，按料液比1g:5mL‑25mL加入0%‑95%的乙醇，于30℃‑70℃下水浴浸提6h，共提取3次，抽滤，合并滤液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，得粗提物；S2、萃取：粗提物按料液比1g:10mL加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，按料液比1g:10mL加入蒸馏水复溶，振荡，4500 r/min离心12min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16 h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，得大孔树脂30%乙醇洗脱相；S4、酸解：取大孔树脂30%乙醇洗脱相 ,按料液比0.1g:50mL加入无水乙醇,而后再加入等体积4M的盐酸,于90℃水浴中酸水解90 min,将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30%乙醇洗脱相酸解物；S5、HSCCC制备分离：配置正己烷‑乙酸乙酯‑甲醇‑水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，采用头‑尾洗脱，将固定相以30 mL/min的流速泵满色谱柱，稳定后，调节转速至700rpm‑900 rpm，将流动相以3mL/min‑6 mL/min的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为30%乙醇洗脱相酸解物,同时通过紫外检测器检测流出物，紫外检测波长设置为280nm，根据峰行收集各组分；S6、组分鉴定：将步骤S5收集到的组分按顺序编号，以对羟基肉桂酸乙酯标准品作为对照，利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定某一编号对应的组分为对羟基肉桂酸乙酯。...

【技术特征摘要】
1.一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取：取粉碎的茶花粉，按料液比1g:5mL-25mL加入0%-95%的乙醇，于30℃-70℃下水浴浸提6h，共提取3次，抽滤，合并滤液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，得粗提物；S2、萃取：粗提物按料液比1g:10mL加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，按料液比1g:10mL加入蒸馏水复溶，振荡，4500r/min离心12min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，得大孔树脂30%乙醇洗脱相；S4、酸解：取大孔树脂30%乙醇洗脱相,按料液比0.1g:50mL加入无水乙醇,而后再加入等体积4M的盐酸,于90℃水浴中酸水解90min,将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30%乙醇洗脱相酸解物；S5、HSCCC制备分离：配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，采用头-尾洗脱，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，稳定后，调节转速至700rpm-900rpm，将流动相以3mL/min-6mL/min的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为30%乙醇洗脱相酸解物,同时通过紫外检测器检测流出物，紫外...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪辉，孙旭，杜希萍，杨远帆，李利君，姜泽东，朱艳冰，肖安风，黄高凌，陈艳红，伍菱，胡阳，杨秋明，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建,35