一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用。具体制备方法为：先选取生物相容性良好的中空介孔二氧化硅（HMSN,HM）为药物载体，首先对索拉非尼（Sorafenib,S）进行装载，通过非共价键方式在其表面包裹适配体anti‑EpCAM功能化的PAMAM（P‑aE），进一步通过静电力在PAMAM外吸附EGRF‑sgRNA/Cas9（E）质粒，从而得到所述多功能纳米药物SE@HM/P‑aE。该多功能纳米药物改善了索拉非尼的水溶性，提高了索拉非尼的生物利用度及基因治疗质粒的转染效率，进一步提高两者的协同抗肿瘤效果，为肿瘤治疗提供了新思路。

Preparation and application of a hollow mesoporous silica co-loaded plasmid based on aptamer modification

The invention discloses a preparation and application of a multifunctional nanomedicine based on an adapter modified hollow mesoporous silica co-carrier plasmid. The specific preparation method is as follows: firstly, hollow mesoporous silica (HMSN, HM) with good biocompatibility is selected as drug carrier. Firstly, sorafenib (S) is loaded, and the functional PAMAM (P_aE) of anti_EpCAM is encapsulated on its surface by non-covalent bonding, and then absorbed outside PAMAM by electrostatic force. The multifunctional nanodrug SE@HM/P_aE was obtained by attaching EGRF_sgRNA/Cas9(E) plasmid. The multi-functional nanodrug improves the water solubility of sorafenib, improves the bioavailability of sorafenib and the transfection efficiency of gene therapy plasmid, further improves the synergistic anti-tumor effect of the two drugs, and provides a new idea for cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用。
技术介绍
肝癌是一种发病率及死亡率较高的最常见的原发性恶性肿瘤，据数据统计每年新增病例近70万，居恶性肿瘤的第三位。目前肝癌的治疗手段主要有手术、放化疗等，其化疗在肝癌治疗过程中尤为重要。临床治疗肝癌的药物众多，但传统化疗药物对肿瘤的靶向性低，副作用大。索拉非尼（Sorafenib）是世界上首个小分子类多靶点的抗肿瘤口服药物，也是现今唯一认可用于治疗肝癌晚期患者的药物，在其抗肝癌方面具有显著的疗效。但是索拉非尼水溶性很低，其生物利用度不高，在用药过程中会诱发一系列的相应的治疗的副作用及不良反应等问题。基因编辑技术是一项目前现代生物医学新型技术，是一种通过人工手段对DNA进行有针对性修饰从而达到改变生物表型为目的的技术。CRISPR/Cas9基因编辑系统是第三代基因编辑技术因具有较高的靶向性及高效的基因编辑效率，使得越来越多的研究者尝试将该技术应用于肿瘤研究领域，同时也显示出了巨大的潜力。目前，经过数十载纳米医药技术的发展，基于纳米技术的药物递送系统逐渐显现出巨大的应用潜力。纳米载体种类繁多，而中空介孔二氧化硅（HMSN）由于其载药量更高、生物相容性更好、高度有序且孔径可控等优点逐渐成为纳米载药系统中运用比较广泛的载体。基于HMSN的种种优点，近年来国内外研究学者以HMSN为药物载体，对肿瘤同时进行PDT及光热治疗（PTT），及基因疗法-化疗、光疗-化疗-成像的多模式诊治已经开展了广泛的研究，并取得了重要的研究成果，均显示出良好的应用前景。适配体的结构碱基是由短的DNA或RNA寡核苷酸组成，通过互补序列的杂交形成复杂的三级或四级结构和靶标（蛋白质、核酸、多肽、金属离子等）能够更高亲和力及高特异性的结合，并且具有低免疫原性、易修饰等优点。聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）是当前在蓬勃发展的新型合成高分子，因其许多独特的性质引起了众多研究者的关注。PAMAM中有大量含N的官能团而且内部具有可变的空腔，具有良好的相容性、分子本身具有纳米尺寸和易修饰等特点。基于以上研究背景，本专利技术制备了一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载索拉非尼和EGRF-sgRNA/Cas9质粒的多功能纳米给药系统，既克服了索拉非尼的水溶性差缺陷，又利用了适配体与PAMAM的偶联物修饰其载体表面增强了药物对癌细胞的靶向，提高了药物利用度。通过基因治疗和化疗联用使药物双重靶向富集于肿瘤细胞，从而有效的提升其临床应用价值。检索国内外相关文献及专利结果表明：基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载索拉非尼和EGRF-sgRNA/Cas9质粒的多功能纳米给药系统的制备，尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建具有良好生物相容性的新型化疗药物和基因药物共传递系统，以化疗药物sorafenib（S）和靶向基因EGFR-sgRNA/Cas9质粒（E）为模型药物，并以适配体anti-EpCAM（aE）与PAMAM（P）的偶联物（P-aE）修饰，构建了一种共载sorafenib与质粒的靶向药物输送系统(SE@HM/P-aE)，改善索拉非尼的水溶性、生物利用度，提高肿瘤细胞对索拉非尼的敏感度，进一步提高两者协同抗癌作用。为实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案：一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备方法，先将中空介孔二氧化硅（HMSN）装载索拉非尼（S），再通过非共价键方式将anti-EpCAM适配体（aE）与PAMAM（P）的偶联物（P-aE）修饰其表面，再通过静电吸附作用装载EGFR-sgRNA/Cas9质粒（E），制得所述基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物，记为SE@HM/P-aE，具体包括以下步骤：1）制备负载索拉非尼的中空介孔二氧化硅纳米颗粒，记为S@HMSN；2）首先将PAMAM-G1、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于水中，随后滴加anti-EpCAM适配体（aE），反应4h，然后选用10Kd的超滤管出去未反应的PAMAM-G1，制得anti-EpCAM适配体与PAMAM的偶联物，记为P-aE偶联物；3）将步骤1）中制备的S@HMSN以及步骤2）中所制备的P-aE偶联物用二次水充分溶解混合，磁力搅拌4h，即得到S@HM/P-aE；4）将步骤3）中制备的S@HM/P-aE，使其超声重悬在二次水中，然后加入EGFR-sgRNA/Cas9质粒（E），低速搅拌过夜，即制得SE@HM/P-aE。步骤1）中所述索拉非尼与中空介孔二氧化硅纳米颗粒的质量之比为4:5。步骤2）中，按质量比计，aE：EDC：NHS=30：12：9；aE与PAMAM-G1的摩尔比为1:10。步骤3）中所述的S@HMSN与P-aE偶联物的质量之比为3000:1。步骤4）中所述的S@HM/P-aE与EGFR-sgRNA/Cas9质粒的质量之比为5：1。所述EGFR-sgRNA/Cas9质粒的制备方法为：通过所设计的靶向基因EGFR-sgRNA与CRISPR/Cas9质粒PX458酶切连接形成；所述靶向基因EGFR-sgRNA的序列为：TGAACCGCACGGCGCCATGC。本专利技术的作用原理：1、中空介孔二氧化硅纳米颗粒是良好的药物递送载体，不仅能靶向识别肿瘤细胞还具有较高的生物相容性；2、该anti-EpCAM适配体修饰的纳米粒可通过肿瘤细胞表面EpCAM蛋白特异性识别，增强其药物的靶向性；3、利用基因治疗抑制肿瘤EGFR基因的高表达，增加化疗药物的敏感性。通过共载系统的使用有效改善了肿瘤的耐药性。本专利技术的优点在于：1、本专利技术以中空介孔二氧化硅为载体，以anti-EpCAM适配体与PAMAM偶联物进行修饰，可改善sorafineb水溶性差的缺点，增强其药物的靶向性，提高其生物利用度；2、本专利技术采用的适配体作为靶向分子，利用其能与肝癌细胞表面高表达的EpCAM蛋白特异性结合的特点，能使利用中空介孔二氧化硅载体负载的sorafineb在肝癌细胞周围富集，并能显著提高细胞对药物的摄取；3、共载化疗药物sorafenib与EGFR-sgRNA/Cas9质粒多功能靶向递送系统不仅提高质粒的转染效率及肿瘤细胞对sorafenib的敏感性，而且较低的毒副作用；4、本专利技术所构建的纳米载药系统也适用于除索拉非尼外的其他毒副作用大或者难溶性的抗癌药物，能够形成稳定均一的纳米粒，均在200nm以下，具有一定的pH响应性；5、本专利技术所涉及的纳米给药系统制备方法简单、材料易得，有利于进一步扩大制备产量。附图说明图1为S@HM以及S@HM/P-aE纳米颗粒中的Sorafenib在不同pH下的释放曲线；图2为实施例3所制备的SE@HM/P-aE粒径分布图（A）及电势图（B）；图3为实施例3所制备的SE@HM/P-aE与对照质粒的凝胶电泳图；图4为实施例6所制备的SE@HM/P-aE孵育细胞与对照质粒转染细胞后的荧光图。图5为实施例7不同纳米实验组别在不同浓度下对HepG2、Huh-7细胞的毒性实验。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备方法，其特征在于：先将中空介孔二氧化硅装载索拉非尼，再通过非共价键方式将anti‑EpCAM适配体与PAMAM的偶联物修饰其表面，再通过静电吸附作用装载EGFR‑sgRNA/Cas9质粒，制得所述基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物，记为SE@HM/P‑aE。

【技术特征摘要】
1.一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备方法，其特征在于：先将中空介孔二氧化硅装载索拉非尼，再通过非共价键方式将anti-EpCAM适配体与PAMAM的偶联物修饰其表面，再通过静电吸附作用装载EGFR-sgRNA/Cas9质粒，制得所述基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物，记为SE@HM/P-aE。2.根据权利要求1所述的基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备方法，其特征在于：包括了以下步骤：（1）制备负载索拉非尼的中空介孔二氧化硅纳米颗粒，记为S@HMSN；（2）首先将PAMAM-G1、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中，随后滴加anti-EpCAM适配体，反应4h，然后滤去未反应的PAMAM-G1，制得anti-EpCAM适配体与PAMAM的偶联物，记为P-aE偶联物；（3）将步骤（1）中制备的S@HMSN以及步骤（2）中所制备的P-aE偶联物用二次水充分溶解混合，磁力搅拌4h，即得到S@HM/P-aE；（4）将步骤（3）中制备的S@HM/P-aE，使其超声重悬在二次水中，然后加入EGFR-sgRNA/Cas9质粒，搅拌过夜，即制得SE@HM/P-aE。3.如权利要求2所述的基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备方法，其特征在于：步骤（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵敬伟，方伊凡，张冰晨，江凯，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35