一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法技术

本发明专利技术公开了一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，包括以下步骤：1)制备多孔硅微粒，并进行表面化学修饰；2)利用多孔硅微粒富集生物样本中的多肽类物质；3)将捕获有生物样本的多肽类物质的多孔硅颗粒与质谱基质混合后直接点靶，进行颗粒原位质谱检测；4)通过统计学算法及人工神经网络构建基于血清肽指纹谱的判别预测模型。本发明专利技术通过多孔硅微粒材料达到一步分离、富集和检测血清样品中低丰度小分子蛋白的作用。3.本发明专利技术基于肽指纹谱通过统计学算法和人工神经网络建立疾病预测模型，能够很好地从大量样本中识别患者，具有较高的特异性和敏感性。本发明专利技术基于肽指纹图谱的疾病判别及监测的质谱试剂盒简单易储存，检测方法准确快捷。

【技术实现步骤摘要】
一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法
本专利技术属于创新的体外诊断质谱检测方法，涉及多肽指纹图谱质谱检测领域，具体涉及一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法。
技术介绍
蛋白质组学(Proteomics)是以一个细胞或组织的基因组所表达的全部蛋白质为研究对象，从整体系统水平上分析细胞、组织或生物体中的蛋白质组成及其活动规律。在肿瘤的研究过程中发现了癌基因、抑癌基因等许多相关基因，正常细胞中癌基因被抑制，抑癌基因处于激活状态，而肿瘤细胞中则相反，基因的激活与抑制最终需要蛋白质参与调节，因此在正常细胞与肿瘤细胞中表达的蛋白、多肽与蛋白酶必定存在差异。同样，肿瘤患者血液及血清中的分子量较小的多肽(<20KD1)也可能由于细胞基因表达及调控，修饰的差异或蛋白酶表达的差异而呈现出不同的特征肽段，且这些低分子量肽段易从细胞和组织中分泌出来进入血液循环，因而特别适合于作为肿瘤液体活检的生物标志物。然而肿瘤患者与正常人群之间往往有多个肽段的差异。因此，需要通过对正常人与癌症患者的肽指纹谱比较和统计学算法分析，实现对肿瘤患者进行判别。基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(M1LDI-TOF-MS)是现阶段用于分析生物样本中多肽和蛋白的主要手段之一，所用基质能从脉冲激光中吸收能量，将其转化为电能，并传递给多肽分子，使其离子化，快速产生样本多肽图谱，整个过程在几秒之内完成，从而实现样本的高通量检测。质谱技术可在单次分析中同时检测出几十个甚至上百个生物标记物，相比于传统诊断技术，M1LDI-TOF的灵敏性、特异性和准确性高，且具有高通量、高效率和低成本的优势。目前M1LDI-TOF-MS技术已经成功应用于多种癌症(如肺癌、子宫癌等)的生物标志物分析。由于M1LDI-TOF对于分子量在1KD-20KD区间的肽段具有极高的分析与检测能力，因而该类仪器特别适合于液体活检中的肽谱分析工具。然而这些含有丰富生物信息的肽段在血液中的含量极少，且易被体液中的蛋白酶分解，此外，在质谱分析之前需去除高峰度蛋白，否则这些高峰度蛋白会吸收激光能量造成肽段质谱信号的损失。因而对肽指纹谱分析之前需对这些肽段进行捕获、富集和保护。现有的肽段捕获与分离富集技术包括免疫层析柱(去除高丰度蛋白)、磁珠(捕获)，洗脱，透析(脱盐)，液相色谱分离等较为繁琐的操作步骤，且成本高、通量低，无法应用于临床分析。因此，解决液体活检肽指纹谱的快速分析及高保真分析(肽谱信息高度保留)，并构建复杂肽谱准确判别方法，对于质谱技术的临床诊断应用至关重要。目前，生物样本和肽谱数据的复杂性，以及缺少配套的快速分析试剂盒、数据库和软件是阻碍肽谱分析技术临床应用的瓶颈。本专利技术提出了一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，本专利技术用于肽指纹图谱检测的质谱试剂盒可以快速获取生物样本的血清肽指纹图谱，利用统计学算法和人工神经网络建立基于血清肽指纹图谱的疾病预测模型，实现临床质谱分析过程的简便性、标准化、高可靠性、高灵敏度和高通量。为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，包括试剂盒，所述试剂盒包括盒体、用于预处理生物样本的多孔硅材料、缓冲溶液及质谱基质，具体包括以下步骤：1)制备多孔硅微粒，并进行表面化学修饰；2)利用多孔硅微粒富集生物样本中的多肽类物质；3)将捕获有生物样本的多肽类物质的多孔硅颗粒与质谱基质混合后直接点靶，进行颗粒原位质谱检测；4)通过统计学算法及人工神经网络构建基于血清肽指纹谱的判别预测模型。进一步，步骤1)的具体过程如下：先将硅晶圆片固定在电解槽中，硅片为阳极，对电极为阴极，以氢氟酸与乙醇混合溶液作为刻蚀液，并设置设置合适的直流电源及刻蚀时间；刻蚀完毕后更换刻蚀液剥离多孔硅层；接着将剥离得到的多孔硅层超声粉碎，得到多孔硅微粒；最后多孔硅微粒通过修饰基团进行表面化学修饰。进一步，步骤2)的具体过程如下：先将生物样本用缓冲溶液适当稀释，然后将稀释生物样本取适量加入0.1-1mg多孔硅微粒中，低速震荡10-30min后离心，去除上清液后用缓冲溶液多次清洗。进一步，步骤3)的具体过程如下：在上述清洗过的多孔硅颗粒中加入适量去离子水，经过震荡混匀后将多孔硅微粒转移至M1LDI靶上进行质谱检测。进一步，步骤4)的具体过程如下：首先将质谱检测得到的多肽图谱进行平滑及减基线处理，后用统计学软件进行t检验挑选出各个生物样本之间有显著差异的多肽特征峰，经过进一步选择得到特征峰，将产生的特征峰数据输入人工神经网络软件中建立判别预测模型。进一步，多孔硅微粒具有微米尺度的颗粒，多孔硅微粒内含高密度纳米尺度垂直孔道，且孔径精细可调。进一步，修饰基团包括金属颗粒、烷基羧酸、季铵盐等其中的一种或多种。进一步，将捕获有生物样本的多肽类物质的多孔硅颗粒直接点靶覆盖质谱基质后进行原位质谱检测，无需洗脱。进一步，生物样本为血清、血浆、血液、尿液、唾液、汗液、脑脊液、组织细胞裂解液等其中的一种或多种。由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：1.本专利技术通过多孔硅微粒材料达到一步分离、富集和检测血清样品中低丰度小分子蛋白的作用。2.本专利技术富集蛋白后的多孔硅微粒材料无需洗脱，可直接进行原位M1LDI-TOF检测，获得高质量的肽谱，提高检测通量。3.本专利技术基于肽指纹谱通过统计学算法和人工神经网络建立疾病预测模型，能够很好地从大量样本中识别患者，具有较高的特异性和敏感性。4.本专利技术基于肽指纹图谱的疾病判别及监测的质谱试剂盒简单易储存，检测方法准确快捷。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步说明：图1为本专利技术中多孔硅微粒和普通金属靶板测试血清质谱图；图2为专利技术中结直肠癌、肝癌和健康人血清M1LDI-TOF质谱图；图3为专利技术中人工神经网络结构图；图4为专利技术中人工神经网络性能测试表现图；图5为专利技术中人工神经网络数据测试矩阵图；图6为专利技术中人工神经网络预测模型ROC曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，包括试剂盒，所述试剂盒包括盒体、用于预处理生物样本的多孔硅材料、缓冲溶液及质谱基质，生物样本为血清、血浆、血液、尿液、唾液、汗液、脑脊液、组织细胞裂解液等其中的一种或多种。具体包括以下步骤：1)制备多孔硅微粒，先将硅晶圆片固定在电解槽中，硅片为阳极，对电极为阴极，以氢氟酸与乙醇混合溶液作为刻蚀液，并设置设置合适的直流电源及刻蚀时间；刻蚀完毕后更换刻蚀液剥离多孔硅层；接着将剥离得到的多孔硅层超声粉碎，得到多孔硅微粒。多孔硅微粒通过修饰基团进行表面化学修饰，修饰基团包括金属颗粒、烷基羧酸、季铵盐等其中的一种或多种。表面化学修饰金属颗粒、烷基羧酸和季铵盐，得到孔道表面有不同修饰基团的三种多孔硅材料。经过表面修饰的多孔硅材料具有微米尺度的颗粒，内含高密度纳米尺度垂直孔道，孔道表面具有修饰基团。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，包括试剂盒，所述试剂盒包括盒体、用于预处理生物样本的多孔硅材料、缓冲溶液及质谱基质，其特征在于包括以下步骤：1)制备多孔硅微粒，并进行表面化学修饰；2)利用多孔硅微粒富集生物样本中的多肽类物质；3)将捕获有生物样本的多肽类物质的多孔硅颗粒与质谱基质混合后直接点靶，进行颗粒原位质谱检测；4)通过统计学算法及人工神经网络构建基于血清肽指纹谱的判别预测模型。

【技术特征摘要】
1.一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，包括试剂盒，所述试剂盒包括盒体、用于预处理生物样本的多孔硅材料、缓冲溶液及质谱基质，其特征在于包括以下步骤：1)制备多孔硅微粒，并进行表面化学修饰；2)利用多孔硅微粒富集生物样本中的多肽类物质；3)将捕获有生物样本的多肽类物质的多孔硅颗粒与质谱基质混合后直接点靶，进行颗粒原位质谱检测；4)通过统计学算法及人工神经网络构建基于血清肽指纹谱的判别预测模型。2.根据权利要求1所述的一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，其特征在于：所述步骤1)的具体过程如下：先将硅晶圆片固定在电解槽中，硅片为阳极，对电极为阴极，以氢氟酸与乙醇混合溶液作为刻蚀液，并设置设置合适的直流电源及刻蚀时间；刻蚀完毕后更换所述刻蚀液剥离多孔硅层；接着将剥离得到的多孔硅层超声粉碎，得到多孔硅微粒；最后所述多孔硅微粒通过修饰基团进行表面化学修饰。3.根据权利要求2所述的一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，其特征在于：所述步骤2)的具体过程如下：先将生物样本用缓冲溶液适当稀释，然后将稀释生物样本取适量加入0.1-1mg多孔硅微粒中，低速震荡10-30min后离心，去除上清液后用缓冲溶液多次清洗。4.根据权利要求3所述的一种肽指纹图谱的快速质谱分析与谱图判别方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬建敏，谈洁，钟巧玲，陈锡胜，栾春燕，余捷凯，
申请(专利权)人：杭州汇健科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33