可见光生物相容反应组合物及其应用制造技术

可见光生物相容反应组合物及其应用，属于生物分子标记技术领域，该组合物由菲醌和烯醚组成，对该组合物照射可见光能够实现在缓冲液及活细胞中的生物大分子的标记成像，同时也能实现生物大分子的时间和空间分辨成像。

Visible Light Biocompatible Reaction Composition and Its Application

Visible light biocompatible reaction compositions and their applications belong to the field of biomolecular marker technology. The compositions consist of Phenanthrenequinone and enol ether. The visible light irradiation of the compositions can realize the marker imaging of biological macromolecules in buffer solution and living cells, and also realize the time and space resolution imaging of biological macromolecules.

【技术实现步骤摘要】
可见光生物相容反应组合物及其应用
本专利技术属于生物分子标记
，具体涉及一种可见光生物相容反应组合物及其应用。
技术介绍
目前可应用于生物分子标记的生物相容反应包括铜催化或环张力诱导的点击化学反应、施陶丁格反应、四嗪反应等。虽然这些生物相容反应已被广泛应用在不同生物大分子的标记中，但是它们均不能实现在不同时间和空间分辨尺度下的生物分子标记中。光，是一种理想的时间和空间调控工具。基于紫外光引发的光点击化学反应利用紫外光产生活性偶极子或者张力炔烃提供了一种时间和空间尺度的标记方法。然而，这些紫外光引发的活性中间体对亲核性的巯基或者水均具有较高的反应性能。因此，发现新的对亲核性的巯基或者水均具有惰性的反应尤为重要。相比于紫外光，可见光对生物体系具有更低的光毒性，然而由可见光引发的生物相容反应鲜有报道。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种可见光生物相容反应组合物及其应用，适用于活细胞中生物大分子的标记、时空分辨成像应用。技术方案：可见光生物相容反应组合物，由菲醌和烯醚组成。优选的，上述菲醌为：所述R1-R8为氨基、酸基、巯基、炔基、叠氮、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇。优选的，上述烯醚为：X为氧或硫；Y为氨基、酸基、巯基、炔基、叠氮、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇。可见光生物相容反应的结构特征如下：可见光生物相容反应的典型特征结构如下：优选的，上述可见光生物相容反应组合物，由乙二醇乙烯基醚修饰的牛血清白蛋白和组成。优选的，上述可见光生物相容反应组合物，由乙二醇乙烯基醚修饰的西妥昔单抗和组成。上述组合物在可见光照射时于生物大分子标记中的应用。上述组合物在可见光照射时于活细胞中生物大分子标记成像中的应用。上述组合物在可见光照射时于生物大分子时间和空间分辨成像中的应用。上述组合物在可见光照射时于生物大分子及小分子药物偶联制备中的应用。上述可见光生物相容反应作为生物大分子标记中的应用。上述可见光生物相容反应作为活细胞中生物大分子标记成像中的应用。上述可见光生物相容反应作为生物大分子时间和空间分辨成像中的应用。上述可见光生物相容反应作为生物大分子及小分子药物偶联制备中的应用。本专利技术采用化学生物学的方法研究基于菲醌-烯醚的可见光生物相容反应及其在生物分子标记中的应用。(一)蛋白/抗体的烯醚标记将蛋白或抗体与烯醚以一定比例溶于磷酸盐缓冲液中，混匀后置于室温放置2小时，通过超滤离心的方法分离纯化预标记的蛋白或抗体。(二)蛋白的凝胶分离及胶内成像将烯醚标记的蛋白与菲醌以一定比例溶于磷酸盐缓冲液中，并用手提的可见光灯照射10分钟后，采用聚丙烯酰胺凝胶分离并进行成像分析。(三)活细胞成像将烯醚标记的抗体与活细胞孵育45分钟后，加入一定比例的罗丹明修饰的菲醌后用手提可见光灯照射不同时间后，利用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像。有益效果：本专利技术提供一种由可见光引发的、基于菲醌-烯醚环加成的生物相容反应，利用这一反应实现了在缓冲液及活细胞中的生物大分子的标记成像，同时实现了生物大分子的时间和空间分辨成像。附图说明图1为可见光生物相容反应产物的荧光图；图2为BSA蛋白标记的浓度依赖标记图；图3为BSA蛋白标记的时间依赖标记图；图4为A549细胞表达EGFR受体的时间分辨成像图；图5为A549细胞表达EGFR受体的空间分辨成像图。具体实施方式实施例1、菲醌及罗丹明修饰菲醌的合成1.化合物2a18-冠醚-6(1.4g，14mmol)和三氧化铬(15g，57mmol)溶于200mL乙酸和20mL水的混合液中，化合物1a(8.5g，38.3mmol)溶于30mL乙酸，60℃反应10小时，TLC检测原料消耗完，反应完毕，加入100mL的水，有大量黄色沉淀生成，过滤，固体依次用乙酸/水(体积比1:1)，二氯甲烷洗两次，烘干后得到淡黄色固体即为化合物2a(8g，80％)。2.化合物4a化合物2a(200mg，0.79mmol)，DCC(246mg，0.95mmol)，NHS(109mg，0.95mmol)溶于四氢呋喃100mL中，室温搅拌12小时，析出大量白色固体。TLC检测原料消耗完，反应完毕。过滤去除析出的固体，溶液减压蒸馏旋干溶剂得到粗品3a。该粗品3a不需要经过进一步纯化，溶于四氢呋喃100mL中，加入boc-乙二胺(152mg，0.95mmol)以及DIEA(387mg，3mmol)，室温搅拌5小时，TLC检测原料消耗完，反应完毕。溶液减压蒸馏旋干溶剂得到的粗品4a，粗品通过制备薄层色谱的方法分离纯化得到黄色固体化合物4a(200mg，产率＝64.3％)。3.PQ-TAMRA化合物4a(200mg，0.5mmol)溶解于80％的TFA，20％的四氢呋喃溶液中，室温搅拌2小时。TLC检测原料消耗完，反应完毕。溶液减压蒸馏旋干溶剂得到的粗品5a。粗品5a溶于5mL二甲基亚砜中，同时加入过量的DIEA(645mg，5mmol)，再加入TAMRA-NHS(264mg，0.5mmol)。室温震荡12小时，HPLC检测反应完全，通过制备HPLC分离纯化得到产物PQ-TAMRA(50mg，产率＝14.2％)。实施例2、乙二醇乙烯基醚活化酯的合成在20mL的二氯甲烷中依次加入乙二醇乙烯醚(888mg，10mmol)，吡啶(4.89g，6mmol)，在冰浴条件下缓慢加入对硝基苯氯甲酸(4.43g，22mmol)，反应过程中有大量白色沉淀生成。原料加完后，逐渐恢复至室温，白色沉淀逐渐溶解，继续搅拌反应12小时，TLC检测原消失反应完毕后，加入50mL水，用二氯甲烷萃取分液，水相用二氯甲烷萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干得粗品，粗产物通过柱层析提纯得到无色液体(2g，80％)。实施例3、菲醌和乙二醇乙烯基醚的光点击反应2a(50mg，0.2mmol)和乙二醇乙烯醚(176mg，20mmol)溶解于100mL乙腈/PBS＝1：1的混合溶剂中。在手提可见光灯的照射下，搅拌20min，TLC检测原消失反应完全。制备HPLC分离纯化产物得淡黄色固体(34mg，50％)。如图1所示，这一反应的产物具有荧光性质，在光照不同时间后，荧光强度逐渐增强。实施例4、牛血清白蛋白(BSA)及西妥昔单抗(cetuximab)的烯醚标记BSA以及cetuximab用PBS(pH＝7.4)配制成2mg/mL的溶液，乙二醇乙烯基醚活化酯加入配制好的蛋白溶液中，终浓度为20mM。室温震荡2小时。将反应也用3KD的超滤管超滤去除过量的小分子。超滤时转速为1500g/min，每次加入500μLPBS一共超滤5次。超滤结束后，收集蛋白溶液。实施例5、BSA蛋白标记及胶内成像将乙二醇乙烯基醚修饰的BSA与菲醌(2a)混合稀释在PBS(PH＝7.4)中，其浓度分别为2mg/mL和0-900μM。随后，利用手提的可见光灯照射不同时间(0-20分钟)，再采用聚丙烯酰胺凝胶进行分离，并利用产物的荧光进行成像。如图2所示，在用光照射10分钟后，BSA蛋白的荧光标记强度与所加入的2a的浓度成正比，且在约300μM达到饱和。如图3所示，当2a的浓度为300μM时，BSA蛋白的荧光强度也与光照时间成正比，且在10分钟光照时间的条件下达到饱和。实施例6、活细胞表面表皮生长因子受体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.可见光生物相容反应组合物，其特征在于由菲醌和烯醚组成。

【技术特征摘要】
1.可见光生物相容反应组合物，其特征在于由菲醌和烯醚组成。2.根据权利要求1所述可见光生物相容反应组合物，其特征在于所述菲醌为：所述R1-R8为氨基、酸基、巯基、炔基、叠氮、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇。3.根据权利要求1所述可见光生物相容反应组合物，其特征在于所述烯醚为：X为氧或硫；Y为氨基、酸基、巯基、炔基、叠氮、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇。4.根据权利要求1所述可见光生物相容反应组合物，其特征在于由乙二醇乙烯基醚修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，李金波，孔好，黄磊，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32