一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法技术

本发明专利技术公开一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法，首先，酪氨酸酶（TYR）通过无铜点击反应与疾病生物标志物的检测抗体结合。另外，将生物素修饰的相应适配体与亲和素包被的96孔板结合，依次加入疾病生物标志物和TYR‑检测抗体。在将过量的TYR‑检测抗体洗涤后加入CuInS2/ZnS QDs‑DA。在疾病生物标志物存在下，TYR能催化氧化CuInS2/ZnS QDs‑DA中的多巴胺部分使其转化为多巴胺醌导致荧光猝灭。通过检测TYR催化氧化CuInS2/ZnS QDs‑DA反应引起的电子转移导致的荧光信号的变化，实现对疾病生物标志物的高灵敏检测。

An indirect immunofluorescence assay based on dopamine modified three quantum dots for detection of disease markers

The invention discloses a method for indirect immunofluorescence detection of disease markers based on dopamine modified ternary quantum dots. Firstly, tyrosinase (TYR) combines with detection antibodies of disease biomarkers through copper-free click reaction. In addition, the corresponding biotin-modified aptamers were combined with 96-well plates coated with avidin, and then the disease biomarkers and TYR_were added to detect antibodies. After washing the excess TYR, the antibody was added to CuInS2/ZnS QDs DA. In the presence of disease biomarkers, TYR can catalyze the oxidation of dopamine in CuInS2/ZnS QDs_DA to convert it into dopamine quinone, resulting in fluorescence quenching. High sensitivity detection of disease biomarkers was achieved by detecting the fluorescence signal changes caused by electron transfer induced by TYR catalytic oxidation of CuInS2/ZnS QDs_DA.

【技术实现步骤摘要】
一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法
本专利技术涉及光学和生化工程领域，特别涉及一种基于多巴胺修饰的三元量子点CuInS2/ZnS用于检测疾病生物标志物的间接荧光免疫传感技术的构建及应用。
技术介绍
疾病生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能因疾病而发生改变或可能发生改变的生化指标，可用于作为疾病的诊断、鉴别诊断、疗效评价、疾病分期、疾病风险评估、预后估计以及健康评价等的辅助性指标。近年来，疾病生物标志物的常规检测方法主要包括仪器分析法和酶联免疫吸附法（ELISA）。其中，仪器分析法由于设备昂贵、操作复杂等缺点无法大面积推广使用。而常规的ELISA检测方法操作流程简单，现阶段已成为实验室诊断的常规手段，但其灵敏度和稳定性容易受到众多因素的干扰，影响结果的均一性和准确性。因此间接的荧光免疫传感技术因其高灵敏性，高选择性和高效性，在检测疾病标志物中引起了越来越多的关注。半导体量子点（QDs）具有独特的光学性质，如高亮度、高量子产率、抗漂白性、稳定性、长荧光寿命、宽的吸收光谱及窄的光致发光（PL）发射光谱，使其成为生物分子诊断及医学诊断的有力工具。近年来，三元量子点因其荧光发射光谱不仅具有尺寸可调性，同时具有组分可调性，这使其在医学领域中具有更广阔的应用前景。常规的荧光免疫检测通过量子点与相应的抗体结合检测荧光信号变化，但是量子点与抗体结合所需的复杂修饰过程是其关键的障碍，对疾病标志物的检测的灵敏度有待提高。通过将氧化还原物质多巴胺（DA）修饰的三元量子点应用于荧光传感技术中，用酪氨酸酶代替量子点与抗体缀合来实现免疫识别，催化多巴胺氧化为多巴胺醌改变量子点的荧光信号。本专利技术避免了量子点与抗体结合的复杂修饰过程，提高了检测的灵敏度。通过间接荧光免疫传感技术，使用高荧光的多巴胺官能化的三元量子点CuInS2/ZnS可实现对特定疾病生物标志物的高灵敏度和高效的检测，并有望推广应用于疾病的诊断及新药的筛选工作中，因而本专利技术具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于多巴胺修饰的三元量子点CuInS2/ZnS的间接荧光免疫传感技术的构建方法，用于疾病生物标志物的高灵敏、高特异性检测。本专利技术的目的是这样实现的，一种多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS的制备方法，包括如下步骤：1）三元量子点CuInS2/ZnS的制备（1）储备液的制备：将0.0034g氯化铜溶解于20mL去离子水中获得0.01M铜储备溶液；将1.106g三氯化铟溶解在5mL乙醇中制备1M铟储备溶液；将2.3528g柠檬酸钠溶解于20mL去离子水中获得0.4M柠檬酸钠储备溶液；将2.408g硫化钠溶解于10mL去离子水中制备1MNa2S储备溶液；将0.176g醋酸锌，0.061g硫脲和0.368gL-谷胱甘肽溶解于20mL去离子水中，用1MNaOH水溶液将pH值调节至5.5〜6.6，获得0.04MZnS壳储备溶液；将上述所有制备的储备溶液在室温中储存并在两周内使用；（2）三元量子点CuInS2/ZnS的制备：将1mL步骤（1）获得的铜储备溶液，0.04mL步骤（1）获得的铟储备溶液，0.40mL步骤（1）获得的柠檬酸钠储备溶液，0.0061gL-谷胱甘肽和20mL去离子水置于50mL三颈烧瓶中；随后，在磁力搅拌下将0.062mL步骤（1）获得的Na2S储备液加入上述的50mL三颈烧瓶中，调节其pH为5.5，在100℃下反应40min获得三元量子点CuInS2反应溶液；将1mL步骤（1）获得的ZnS壳储备溶液加入三元量子点CuInS2反应溶液中反应45min，再重复加入3次，最后得到三元量子点CuInS2/ZnS；2）多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS的制备首先将10mL0.2M步骤1）获得的CuInS2/ZnS量子点溶液放入烧瓶中，加入0.1mL3-巯基丙酸，将其pH值调节至10.8获得混合物，其中三元量子点CuInS2/ZnS在500nm的激发光激发下的最大发射波长为750nm，随后，将该混合物加热至100℃，并在该温度下反应1.5h，获得羧基修饰的三元量子点CuInS2/ZnS；然后，在搅拌下加入2mL浓度为0.1M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应35min后，在搅拌下注入2mL浓度为0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺反应1h，随后将所制备的溶液用异丙醇洗涤并分散在10mL浓度为0.05M，pH=6.5磷酸钾缓冲溶液（KBS）中，获得三元量子点CuInS2/ZnS；将不同量的多巴胺加入到上述的三元量子点CuInS2/ZnS中，将pH保持在6.5，通氮气除去溶解的氧气，将此反应混合物放置2h，获得多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS（CuInS2/ZnSQDs-DA），然后于4℃下储存直至使用。本专利技术的目的是这样实现的，一种酪氨酸酶-Tau抗体的制备方法，包括如下步骤：1）将酪氨酸酶（TYR）和Tau蛋白检测抗体分别溶解在浓度为0.05M，pH=6.5的KBS中获得酪氨酸酶的KBS溶液和Tau抗体的KBS溶液；2）通过将N-羟基琥珀酰亚胺-叠氮化物（NHS-叠氮化物）和N-羟基琥珀酰亚胺-二苯并环辛基（NHS-DBCO）分别溶解在二甲基亚砜中获得NHS-叠氮化物的二甲基亚砜溶液和NHS-DBCO的二甲基亚砜溶液；3）将100μL浓度为100nM酪氨酸酶的KBS溶液与5μL浓度为100μM的NHS-叠氮化物的二甲基亚砜溶液混合，同时，将100μL浓度为100nM的Tau蛋白检测抗体的KBS溶液和5μL浓度为100μM的NHS-DBCO的二甲基亚砜溶液混合，将此反应溶液在室温下温育30min直至缀合反应完成，随后，将5μL浓度为1M、pH=8的Tris-HCl加入到上述反应溶液中反应5min，使反应终止，获得Tau抗体-DBCO和TYR-叠氮化物缀合物；4）采用分子量为30K的超滤离心管分别纯化Tau抗体-DBCO和TYR-叠氮化物缀合物，之后，通过将50μL浓度为100nM的Tau抗体-DBCO溶液与50μL浓度为100nM的TYR-叠氮溶液混合，在室温下反应2h，获得TYR-Tau抗体。本专利技术的目的是这样实现的，一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法，包括如下步骤：1）酪氨酸酶（TYR）通过无铜点击反应与疾病生物标志物的检测抗体结合；2）将生物素修饰的相应适配体与亲和素包被的96孔板结合，依次加入疾病生物标志物和TYR-检测抗体；3）在将过量的TYR-检测抗体洗涤后加入CuInS2/ZnSQDs-DA中；4）在疾病生物标志物存在下，TYR能催化氧化CuInS2/ZnSQDs-DA中的多巴胺部分使其转化为多巴胺醌导致荧光猝灭，通过检测TYR催化氧化CuInS2/ZnSQDs-DA反应引起的电子转移导致的荧光信号的变化，实现对疾病生物标志物的高灵敏检测。步骤1）的酪氨酸酶（TYR）通过无铜点击反应与疾病生物标志物的检测抗体结合获得TYR-Tau抗体，其制备方法如下：1）将酪氨酸酶（TYR）和Tau蛋白检测抗体分别溶解在浓度为0.05M，pH=6.5的KBS中获得酪氨酸酶的KBS溶液和Tau抗体的KB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多巴胺功能化的三元量子点 CuInS2/ZnS 的制备方法，包括如下步骤：1）三元量子点 CuInS2/ZnS 的制备（1）储备液的制备：将 0.0034 g 氯化铜溶解于 20 mL 去离子水中获得0.01 M 铜储备溶液；将 1.106 g三氯化铟溶解在 5 mL 乙醇中制备 1 M 铟储备溶液；将 2.3528 g 柠檬酸钠溶解于 20 mL 去离子水中获得 0.4 M 柠檬酸钠储备溶液；将 2.408 g 硫化钠溶解于 10 mL 去离子水中制备 1 M Na2S 储备溶液；将 0.176 g 醋酸锌，0.061 g 硫脲和 0.368 g L‑谷胱甘肽溶解于 20 mL 去离子水中，用 1 M NaOH 水溶液将 pH 值调节至 5.5〜6.6，获得 0.04 M ZnS 壳储备溶液；将上述所有制备的储备溶液在室温中储存并在两周内使用；（2）三元量子点 CuInS2/ZnS 的制备：将 1 mL 步骤（1）获得的铜储备溶液，0.04 mL 步骤（1）获得的铟储备溶液，0.40 mL 步骤（1）获得的柠檬酸钠储备溶液，0.0061 g L‑谷胱甘肽和 20 mL 去离子水置于 50 mL 三颈烧瓶中；随后，在磁力搅拌下将 0.062 mL步骤（1）获得的 Na2S 储备液加入上述的50 mL 三颈烧瓶中，调节其 pH 为5.5，在 100 ℃ 下反应40 min获得三元量子点 CuInS2反应溶液；将 1 mL 步骤（1）获得的ZnS 壳储备溶液加入三元量子点 CuInS2反应溶液中反应 45 min，再重复加入 3 次，最后得到三元量子点 CuInS2/ZnS；2）多巴胺功能化的三元量子点 CuInS2/ZnS 的制备首先将10 mL 0.2 M 步骤1）获得的CuInS2/ZnS 量子点溶液放入烧瓶中，加入 0.1 mL 3‑巯基丙酸，将其 pH 值调节至 10.8获得混合物，其中三元量子点 CuInS2/ZnS 在 500 nm的激发光激发下的最大发射波长为 750 nm，随后，将该混合物加热至 100 ℃，并在该温度下反应 1.5 h，获得羧基修饰的三元量子点 CuInS2/ZnS；然后，在搅拌下加入2 mL 浓度为0.1 M的 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，反应 35 min 后，在搅拌下注入2 mL浓度为0.1 M的 N‑羟基琥珀酰亚胺反应 1 h，随后将所制备的溶液用异丙醇洗涤并分散在 10 mL 浓度为0.05M，pH = 6.5磷酸钾缓冲溶液（KBS）中，获得三元量子点 CuInS2/ZnS；将不同量的多巴胺加入到上述的三元量子点 CuInS2/ZnS中，将 pH 保持在 6.5，通氮气除去溶解的氧气，将此反应混合物放置 2 h，获得多巴胺功能化的三元量子点 CuInS2/ZnS（CuInS2/ZnS QDs‑DA），然后于 4 ℃ 下储存直至使用。...

【技术特征摘要】
1.一种多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS的制备方法，包括如下步骤：1）三元量子点CuInS2/ZnS的制备（1）储备液的制备：将0.0034g氯化铜溶解于20mL去离子水中获得0.01M铜储备溶液；将1.106g三氯化铟溶解在5mL乙醇中制备1M铟储备溶液；将2.3528g柠檬酸钠溶解于20mL去离子水中获得0.4M柠檬酸钠储备溶液；将2.408g硫化钠溶解于10mL去离子水中制备1MNa2S储备溶液；将0.176g醋酸锌，0.061g硫脲和0.368gL-谷胱甘肽溶解于20mL去离子水中，用1MNaOH水溶液将pH值调节至5.5〜6.6，获得0.04MZnS壳储备溶液；将上述所有制备的储备溶液在室温中储存并在两周内使用；（2）三元量子点CuInS2/ZnS的制备：将1mL步骤（1）获得的铜储备溶液，0.04mL步骤（1）获得的铟储备溶液，0.40mL步骤（1）获得的柠檬酸钠储备溶液，0.0061gL-谷胱甘肽和20mL去离子水置于50mL三颈烧瓶中；随后，在磁力搅拌下将0.062mL步骤（1）获得的Na2S储备液加入上述的50mL三颈烧瓶中，调节其pH为5.5，在100℃下反应40min获得三元量子点CuInS2反应溶液；将1mL步骤（1）获得的ZnS壳储备溶液加入三元量子点CuInS2反应溶液中反应45min，再重复加入3次，最后得到三元量子点CuInS2/ZnS；2）多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS的制备首先将10mL0.2M步骤1）获得的CuInS2/ZnS量子点溶液放入烧瓶中，加入0.1mL3-巯基丙酸，将其pH值调节至10.8获得混合物，其中三元量子点CuInS2/ZnS在500nm的激发光激发下的最大发射波长为750nm，随后，将该混合物加热至100℃，并在该温度下反应1.5h，获得羧基修饰的三元量子点CuInS2/ZnS；然后，在搅拌下加入2mL浓度为0.1M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应35min后，在搅拌下注入2mL浓度为0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺反应1h，随后将所制备的溶液用异丙醇洗涤并分散在10mL浓度为0.05M，pH=6.5磷酸钾缓冲溶液（KBS）中，获得三元量子点CuInS2/ZnS；将不同量的多巴胺加入到上述的三元量子点CuInS2/ZnS中，将pH保持在6.5，通氮气除去溶解的氧气，将此反应混合物放置2h，获得多巴胺功能化的三元量子点CuInS2/ZnS（CuInS2/ZnSQDs-DA），然后于4℃下储存直至使用。2.一种酪氨酸酶-Tau抗体的制备方法，包括如下步骤：1）将酪氨酸酶（TYR）和Tau蛋白检测抗体分别溶解在浓度为0.05M，pH=6.5的KBS中获得酪氨酸酶的KBS溶液和Tau抗体的KBS溶液；2）通过将N-羟基琥珀酰亚胺-叠氮化物（NHS-叠氮化物）和N-羟基琥珀酰亚胺-二苯并环辛基（NHS-DBCO）分别溶解在二甲基亚砜中获得NHS-叠氮化物的二甲基亚砜溶液和NHS-DBCO的二甲基亚砜溶液；3）将100μL浓度为100nM酪氨酸酶的KBS溶液与5μL浓度为100μM的NHS-叠氮化物的二甲基亚砜溶液混合，同时，将100μL浓度为100nM的Tau蛋白检测抗体的KBS溶液和5μL浓度为100μM的NHS-DBCO的二甲基亚砜溶液混合，将此反应溶液在室温下温育30min直至缀合反应完成，随后，将5μL浓度为1M、pH=8的Tris-HCl加入到上述反应溶液中反应5min，使反应终止，获得Tau抗体-DBCO和TYR-叠氮化物缀合物；4）采用分子量为30K的超滤离心管分别纯化Tau抗体-DBCO和TYR-叠氮化物缀合物，之后，通过将50μL浓度为100nM的Tau抗体-DBCO溶液与50μL浓度为100nM的TYR-叠氮溶液混合，在室温下反应2h，获得TYR-Tau抗体。3.一种基于多...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩志钟，陈丽，陈敬华，李春艳，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35