SPACA7基因的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种SPACA7基因的用途，其用于制备检测非梗阻无精子症的产品。该产品包括一对特异性扩增SPACA7基因的引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。通过SPACA7基因，为非梗阻性无精子症的检测提供了一种新的检测指标。仅需一对引物通过RT‑PCR检测即可实现正常生育者和无精子症患者的区分检测，整个操作过程更加简易，耗时短，利于临床检验。

Use of SPACA7 Gene

The invention discloses the use of SPACA7 gene for preparing products for detecting non-obstructive azoospermia. The product includes a pair of primers specifically amplifying SPACA7 gene. The sequence of the upstream primers is shown in SEQ ID NO:1 and the downstream primers are shown in SEQ ID NO:2. SPACA7 gene provides a new detection index for non-obstructive azoospermia. Only one pair of primers can be detected by RT -PCR to distinguish normal fertility from azoospermia patients. The whole procedure is simpler, time-consuming and convenient for clinical testing.

【技术实现步骤摘要】
SPACA7基因的用途
本专利技术属于基因工程技术和生殖医学领域，尤其是关于一种非梗阻无精子症检测试剂盒。
技术介绍
根据世界卫生组织的统计资料，不孕不育症占育龄夫妇的20％左右，其中男性因素导致不孕不育约占50％。男性不育症给个人、家庭和社会带来了沉重的负担，世界卫生组织宣布，不育症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病之一。随着社会工业化程度的提高和生活节奏的加快，加上环境污染和不良生活习惯等因素，男性精液质量日趋下降，无精子症、少精子症和弱精子症等男性不育患者人数逐年上升，男性生殖健康的问题越来越受到全社会的关注。目前男性不育症的诊断主要基于标准精液分析，包括精液参数分析，如精子的浓度、精子的运动性和精子形态、活力等，但在很多情况下，常规精液分析对于预测精子生育力十分有限。仅通过常规精液参数分析不足以区分可育受试者和不育受试者，例如，具有正常精子计数不与生育力同义，减少的计数不代表不育。常规精液参数分析在许多情况下不能检测到任何异常，这在不孕或反复辅助生殖失败与正常常规精液参数的情况下尤其明显。因此假设在这些情况下存在异常精子功能或分子缺陷，必须考虑其它精子特征，并触发旨在鉴定新的潜在生物分子标志物的进一步研究。特别地，重要的是考虑精子DNA改变，例如DNA完整性、染色质包装缺陷、细胞凋亡、氧化应激、DNA断裂和非整倍性等。精子DNA的完整性对于精子功能和胚胎发育至关重要，损伤的DNA可能对胎儿发育、后代健康、胚泡发育、受精卵着床和流产等有重要影响。精子DNA完整性被认为是男性不育症诊断中越来越重要的参数。精子顶体相关蛋白7(SPACA7)属于精子顶体结合蛋白家族成员，在人类、小鼠、黑猩猩、猕猴中有同源物，但是这些蛋白没有保守的结构域，并且其功能尚不明确。人SPACA7基因定位于染色体13q34位点，其cDNA长度773bp，在32-619bp之间有一阅读框，含有588bp的完整开放阅读框，编码一个由195个氨基酸组成、分子量为21.48KDa的蛋白质，等电点4.65,32-34处为起始密码子ATG，617-619处为终止密码子TGA，SPACA7蛋白在1-19位氨基酸处有跨膜区。该蛋白主要在成熟的精子中表达，在支持细胞、精原细胞中不表达。深圳市第二人民医院申请了公开号为CN105176976A、名称为“一种检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对”和公开号为CN106170562A、名称为“一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒”以及公开号为CN104531683A、名称为“一种与非梗阻性无精子症相关的遗传标记”等专利技术专利申请，其特点是采用高通量测序的方法筛选到无精子症患者中基因的突变位点，利用不同的引物对来检测，但其缺点是所需引物对较多，PCR操作繁琐。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的非梗阻无精子症检测试剂盒。本专利技术提供一种SPACA7基因的用途，其用于制备检测非梗阻无精子症的产品。所述检测非梗阻无精子症的产品是用RT-PCR检测非梗阻无精子症的产品。该产品也可以是能够检测非梗阻无精子症的基因芯片。所述用RT-PCR检测非梗阻无精子症的产品包括一对特异性扩增SPACA7基因的引物，其上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：2所示。一种非梗阻无精子症检测试剂盒，其能够特异性识别SPACA7基因。所述的检测试剂盒包括SPACA7上游引物和SPACA7下游引物，所述上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO：2所示。一种扩增SPACA7基因的引物的用途，其用于制备检测非梗阻无精子症的产品。所述产品是用RT-PCR检测非梗阻无精子症的产品，所述引物包括序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及序列如SEQIDNO：2所示的下游引物。SPACA7基因在非梗阻性无精子症中表达消失。SPACA7基因在检测非梗阻性无精子症中的应用，包括下述步骤：(1)取非梗阻性无精子症的精液样本提取样本的RNA；(2)对样本的RNA进行逆转录，得到样本的cDNA；(3)以步骤(2)获得的样本cDNA为模板，以引物对P为引物，进行RT-PCR反应，将非梗阻性无精子症精液样本中的SPACA7基因的mRNA表达量与正常生育者精液样本中的SPACA7基因的mRNA表达量进行对比，当样本中SPACA7基因的mRNA表达消失时，该样本为非梗阻性无精子症样本；其中引物对P为：SPACA7上游引物：5'ATGGCAGTGAGCCAAGGAGAC3'(SEQIDNO：1)SPACA7下游引物：5'TCACTGACTGCCTTGGCTCCT3'(SEQIDNO：2)。所述RT-PCR的条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃15秒、55℃30秒、72℃40秒,40个循环；72℃7分钟，1个循环；4℃保温。该应用可以是通过对睾丸穿刺活检样本进行免疫组化检测，当样本中SPACA7蛋白的表达消失时，该样本为非梗阻性无精子症样本。本专利技术的有益效果是：1)通过SPACA7基因，为非梗阻性无精子症的检测提供了一种新的检测指标。2)仅需一对引物通过RT-PCR检测即可实现正常生育者和无精子症患者的区分检测，整个操作过程更加简易，耗时短，利于临床检验。附图说明图1是正常生育男性(Lane1-6)及非梗阻性无精子症患者(Lane7-12)中SPACA7基因扩增凝胶图谱，其能够反映SPACA7的mRNA的表达在非梗阻性无精子症患者的精液样本和正常生育者精液样本之间的对比结果；图2是运用免疫组化染色显示SPACA7在非梗阻性无精子症患者睾丸活检样本和正常生育者睾丸活检样本中的不同显色效果图，其中，A：阴性对照(不加SPACA7抗体，40×)；B：SPACA7蛋白在正常生育者睾丸组织中的表达(40×)；C：SPACA7在非梗阻性无精子症患者睾丸组织中的表达(40×)；D：SPACA7在非梗阻性无精子症患者睾丸组织中的表达(100×)；标尺＝50μm。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。一、样本与试剂：(一)样本：1.所有患者都是在深圳市第二人民医院生殖医学中心进行病理诊断和临床诊断后确诊的非梗阻性无精子症患者；2.所有患者年龄大于18岁；3.精液样本是患者禁欲3-7天之后通过手淫获取；4.睾丸穿刺活检样本是于该生殖医学中心获得；5.所有样本都是新鲜样本，获得之后立即处理进行实验。(二)试剂：(1)RNAlater(2)DNaseI(RNaseFree，美国，Promega)(3)Trizol试剂溶液(Invitrogen；Garlsbad，美国)(4)Oligo(dT)18beads(Invitrogen，美国)(5)逆转录酶(M-MLV)(Fermentas，美国)(6)RT-PCR仪(ABI7000)(美国应用生物系统公司)本专利技术中涉及到上述试剂的使用均按照试剂使用说明中的步骤进行操作。实验例1：RT-PCR检测SPACA7基因的mRNA在非梗阻性无精子症中表达消失。(一)样本信息：44例非梗阻性无精子症患者和30例正常生育者的信息如表1所示：表1.样本信息(1-44为非梗阻性无精子症患者，45-74为正常生育者)(二)方法：1、样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SPACA7基因的用途，其特征在于，用于制备检测非梗阻无精子症的产品。

【技术特征摘要】
1.一种SPACA7基因的用途，其特征在于，用于制备检测非梗阻无精子症的产品。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测非梗阻无精子症的产品包括：用RT-PCR或基因芯片检测非梗阻无精子症的产品。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用RT-PCR检测非梗阻无精子症的产品包括一对特异性扩增SPACA7基因的引物，其上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：2所示。4.一种非梗阻无精子症检测试剂盒，其特征在于，能够特异性识别...

【专利技术属性】
技术研发人员：张菁华，刘井清，张丹，唐爱发，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44