一种微量RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种微量RNA的提取方法。步骤:样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。本发明专利技术提供了一种适用于血小板的微量RNA提取方法，目的在于从低至1×10

A Method for Extracting Trace RNA

The invention discloses a method for extracting micro RNA. Steps: Sample lysis: complete platelet lysis and release of RNA; RNA separation: RNA was separated from the sample by nucleic acid assisted precipitator combined with magnetic beads; nucleic acid assisted precipitator was glycogen; RNA purification: removal of non-specific binding DNA and protein impurities in magnetic beads. The invention provides a method for extracting microRNA suitable for platelets, aiming at from low to 1*10.

【技术实现步骤摘要】
一种微量RNA的提取方法
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种微量RNA的提取方法。
技术介绍
RNA提取是进行以RNA研究为主的分子生物学研究的基础，是研究基因表达的关键步骤。血小板RNA检测作为一种新型液体活检技术，在癌症筛查与心血管疾病的研究和监控中有着极为重要的应用前景。1×105个血小板中总RNA含量约为100pg，其质量仅相当于10个白细胞的RNA。如何从起始量极少的样本中提取高质量的RNA应用于下游实验，是亟待解决的课题。传统的酚氯仿法和CTAB法等RNA提取方法，所需样本的初始量大，需要大于1×105个细胞或5mg组织，无法进行微量样本RNA的提取。现有的吸附柱法采用硅胶膜技术，对样本的起始量亦有较严格的要求，且在洗脱过程中无法完全释放RNA，对RNA造成较大的损耗，使得得率降低。传统方法采用醇沉方式沉淀RNA，然而在较大的体积中，微量RNA样本难以沉淀；并且已沉淀的微量样本由于肉眼不可见，很容易在后续的洗涤过程中损失。并且在采取去污剂裂解细胞的RNA提取方法中，去污剂(如CTAB、SDS等)的残留将极大影响后续反应。现有的柱提法与磁珠法大多数也只适用于大量RNA的提取，对于极微量RNA的提取也有洗脱体积的限制。
技术实现思路
本专利技术针对现有RNA提取技术的不足之处，提供一种适用于血小板的低起始量、高得率、高质量且安全的RNA提取方案，同时也适用于从痕量细胞中提取RNA。分离纯化后的RNA可直接用于后续实验，如实时荧光定量PCR和RNA测序等。目的在于从低至1×105个血小板或10个细胞中分离到高质量且足量的RNA，以供下游实验和分析。本专利技术主要针对传统RNA提取方法存在的起始量大、RNA得率低、杂质多、无法提取微量样本RNA等问题做出了改进，从痕量样本中所分离的RNA得率高、完整性好，符合下游实验的需求。洗脱体积小，也可在不经分离磁珠与核酸的条件下进行逆转录等下游实验。为实现上述目的，本专利技术提供一种微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。进一步，所述RNA纯化步骤后，还包括RNA洗脱步骤；优选的，所述RNA洗脱步骤为采用含核酸保护剂的洗脱液进行洗脱获得稳定的RNA溶液。进一步，所述样本裂解为，取样本，加入裂解液，涡旋混匀，室温静置。进一步，所述样本的体积量可低至10个细胞，或1×105个血小板。进一步，所述裂解液含异硫氰酸胍和糖原；优选的，裂解液配方为：5M异硫氰酸胍，20mMEDTA，10mMTris-HClpH6.4，0.1％20mg/mL糖原；任选的，当样本为一定体积的样本时，所述样本与裂解液L的体积比例为1:(3～5)；优选的，样本与裂解液L的体积比例为1:4。进一步，所述RNA分离为，用缓冲液沉淀RNA，并使其吸附于磁珠B，其中缓冲液含有异丙醇和LiCl；优选的，缓冲液的配方为2MLiCl，80W/V％异丙醇。进一步，所述RNA分离为，加入等体积缓冲液，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；再加入1/10体积磁珠B悬浮液涡旋混匀，室温静置；再将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体。进一步，所述RNA纯化为，加入80v/v％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。进一步，所述RNA纯化为，加入80％乙醇，涡旋混匀，将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去管中液体，重复洗涤1次，移去离心管中液体后，开盖使酒精完全挥发；将管从磁力架上取下，加入洗涤液D，涡旋混匀，室温放置，期间间隔轻弹混匀；再加入同样体积的洗涤液W，涡旋混匀，室温静置；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；再加入80％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。进一步，所述RNA洗脱为，将管从磁力架上取下，加入洗脱液，轻弹混匀，短暂离心甩下；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，转移洗脱液至干净的离心管中即可。本专利技术采用含有高浓度异硫氰酸胍(GuSCN)的裂解液裂解细胞，除去样本中的细胞碎片及释放样本RNA。高浓度异硫氰酸胍能有效变性蛋白质、裂解细胞膜，释放细胞中的物质，抑制RNA酶活性，保证了RNA的完整性。其中的0.1％糖原(Glycogen)起到稳定RNA，并有助于下一步有效沉淀RNA的作用。可选地，采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法从样本中高效分离RNA，其特征在于，溶液中的核酸可在高浓度异丙醇和LiCl的存在下产生疏水作用而被沉淀，同时溶液中的糖原使得RNA的沉淀更加完全。在异硫氰酸胍溶液中，磁珠表面的硅烷醇基团通过疏水作用、氢键作用和静电作用与核酸发生特异性结合。缓冲液的主要成分为异丙醇和LiCl，LiCl是一种可使RNA溶解度降低的强脱水剂，能沉淀RNA和蛋白质；糖原、异丙醇、LiCl能最大限度沉淀RNA。在异硫氰酸胍溶液中，磁珠表面的硅烷醇基团通过疏水作用、氢键作用和静电作用与核酸发生特异性结合，而不与其他杂质结合。可选地，经过洗涤去除大部分的蛋白质等杂质后，采用DNAseI处理结合核酸的磁珠，可特异性地除去DNA杂质。可选地，采用含核酸保护剂(糖原)的洗脱液获得稳定的RNA溶液，在低盐条件下，RNA从磁珠洗脱下来，且洗脱液中的糖原起到稳定RNA的作用。80％乙醇洗涤除去部分残留的蛋白质。如果为无白细胞污染的血小板，则不需除DNA；但80％乙醇洗涤不可省。如果为白细胞污染的血小板，则除蛋白后，待酒精完全挥发后，使用含DnaseI的洗涤液D特异性地消化DNA，然后用80％乙醇除去DnaseI等杂质。在去除其他杂质的同时，洗涤液W中异硫氰酸胍和糖原使RNA稳定结合于磁珠。洗脱液中，Tris-HCl维持溶液pH，糖原辅助稳定RNA。低盐条件下，RNA从磁珠洗脱下来。与现有技术相比，本专利技术提供了一种适用于血小板的微量RNA提取方法，目的在于从低至1×105个血小板或10个细胞中分离到高质量且足量的RNA，以供下游实验和分析。本专利技术主要针对传统RNA提取方法存在的起始量大、RNA得率低、杂质多等问题做出了改进，从痕量样本中所分离的RNA得率高、完整性好，符合下游实验的需求。本专利技术所述方法的洗脱体积小，且可控。附图说明图1是经本专利技术方法所得RNA的质量检测结果图。图2是本专利技术方法所提的RNA进行逆转录并扩增再进行毛细管电泳的结果图。图3是柱提法所提的RNA进行逆转录并扩增再进行毛细管电泳的结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。

【技术特征摘要】
1.一种微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。2.根据权利要求1所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA纯化步骤后，还包括RNA洗脱步骤；优选的，所述RNA洗脱步骤为采用含核酸保护剂的洗脱液进行洗脱获得稳定的RNA溶液。3.根据权利要求1或2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述样本裂解为，取样本，加入裂解液，涡旋混匀，室温静置。4.根据权利要求3所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述样本的体积量可低至10个细胞，或1×105个血小板。5.根据权利要求3所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述裂解液含异硫氰酸胍和糖原；优选的，裂解液配方为：5M异硫氰酸胍，20mMEDTA，10mMTris-HClpH6.4，0.1％20mg/mL糖原。6.根据权利要求1或2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA分离为，用缓冲液沉淀RNA，并使其吸附于磁珠B，其中缓冲液含有异丙醇和LiCl；优选的，缓冲液的配方为2MLiCl，80W/V％异丙醇。7.根据权利要求6所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA分离为，加入等体积缓冲液，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；再加入1/10体积磁珠B悬浮液涡旋混匀，室温静...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欣欣，叶国栋，许剑雄，陈茂立，韩大雄，郭奇伟，肖剑萍，蔡逸民，杨燕燕，李顺杰，董康梅，朱莎莎，张丽芳，宋丹，
申请(专利权)人：厦门生命互联科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35