一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用，属于神经系统基因功能研究技术领域。本发明专利技术小鼠脊髓体外电转基因方法，包括：将胚鼠从母鼠子宫中取出，剥离出所述胚鼠的脊髓，将含有目的基因的质粒注射到所述离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。将电转后的脊髓进行组织切片培养，利用该方法可以建立小鼠脊髓电转组织切片培养模型，为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法，从而寻找治疗脊髓疾病的有效手段；该方法更适合神经元的动态变化观察，是介于活体与细胞之间的一种研究技术。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用
本专利技术涉及一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用，属于神经系统基因功能研究

技术介绍
哺乳动物胚胎发育是在母体内进行，因此，在胚胎发育过程进行神经节系统异常的研究较为困难。小鼠是一种常用的实验模式动物，在前期的研究过程，我们已经在小鼠模型中进行了小鼠子宫内电转基因技术，该技术实现了在小鼠胚胎早期大脑皮层外源基因的异常表达，在特定阶段进行分析其对大脑皮层的影响(杨慈清,李小英,卢习,等.小鼠子宫内电转基因方法的建立[J].解剖学杂志,2013,36(2):170-172.)。随着活体电转基因技术的出现，可以实现外源基因在活体中不同组织器官的异常表达。脊髓是中枢神经系统重要的组成部分，具有十分重要的功能，比如反射、运动、传导等。脊髓一旦出现损伤，将会给机体造成严重的后果，比如肌肉萎缩，呼吸麻痹，甚至死亡(DanesinCathy,SoulaCathy.MovingtheShhSourceoverTime:WhatImpactonNeuralCellDiversificationintheDevelopingSpinalCord？[J].JDevBiol,2017,5(2):1-17；O'SheaTimothyM,BurdaJoshuaE,SofroniewMichaelV.Cellbiologyofspinalcordinjuryandrepair.[J].J.Clin.Invest,2017,127(9):3259-3270.)。脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，它的正常发育对机体至关重要，一旦其中某些基因的表达出现异常，就出对它的结构和功能产生一定的影响，从而对机体造成损伤。小鼠胚胎是一种研究中枢神经系统基因功能的常用动物模型，子宫内基因电转技术的应用，使外源基因在小鼠胚胎大脑皮层中异常表达成为可能。将外源基因注入大脑中的特定部位，用于研究外源基因的异常表达对特定部位神经发育的影响，杨慈清等利用子宫内基因电转技术成功的在大脑皮层部位表达了GFP阳性细胞(杨慈清,李小英,卢习,等.小鼠子宫内电转基因方法的建立[J].解剖学杂志,2013,36(2):170-172.)。但是在研究鼠胚脊髓神经发育时，要准确的将外源基因注入胚鼠脊髓腔并进行电转，操作难度过高，不易实现，目前未见相关研究报道。杨慈清等利用鸡胚的原位活体电转技术，将pCAGGS-GFP质粒转染到脊髓一侧，成功的建立了一种鸡胚脊髓活体电转的技术(杨慈清,毛会丽,林俊堂.鸡胚培养及活体电转基因方法的建立[J].解剖学报,2012,43(04):564-568.)。但到目前为止，未见在小鼠脊髓中进行电转基因的研究，由于在小鼠子宫内将外源基因准确注射到胚胎脊髓腔内非常困难，因此外源基因难以转入脊髓中，对于外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响的研究，也遇到了很大的困难。因此，建立胚胎发育过程脊髓中外源基因异常表达模型对于脊髓异常结构形成的研究具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠脊髓体外电转基因方法，该方法为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法。本专利技术还提供了一种小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，该方法能够制备出小鼠脊髓电转组织体外培养切片。本专利技术还提供了上述模型建立方法的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种小鼠脊髓体外电转基因方法，包括：将含有目的基因的质粒注射到胚鼠离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。脊髓为长管状，电极位于脊髓宽度方向左右两侧。所述胚鼠离体脊髓由如下方法获得，将胚鼠从母鼠子宫中取出，剥离出所述胚鼠的脊髓，得离体脊髓。本专利技术中建立一种小鼠胚胎早期脊髓体外电转基因方法，并可以在电转后对脊髓进行切片，然后进行组织片培养，在培养过程中对外源基因对神经元的作用进行观察和分析，是介于活体与细胞之间的一种研究技术，该技术为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法。本专利技术中的方法取出胚胎并剥离脊髓，有便于在显微镜下观察并准确操作，降低了操作难度，并在电转后短时间内实现脊髓切片并培养，保证了细胞不会死亡，该方法需要与组织片培养技术结合。所述胚鼠应为11-13天的胚鼠。本专利技术的电转基因方法适合选用胚胎发育在11-13d的早期胚胎，胚鼠脊髓腔在发育最初阶段是慢慢扩大的过程，到11d左右，腔体最大，随着发育的继续，到13d左右，腔体封闭。当胚胎小于11天时，胚鼠个体太小，脊髓难以剥离；当胚胎发育大于13d后，脊髓腔体便封闭，无法将质粒注入到脊髓腔，很难实现正确转染。因此，优选的，本申请的方法选用11天的胚鼠。在剥离脊髓时，将胚鼠的脊髓连同椎管一同剥离。所述注射为用显微注射毛细玻璃针通过吹入的方式将所述质粒注射到脊髓腔内。该操作在体视显微镜下进行。所述电转的条件为：电压33-37V，每次脉冲55-65ms，间隔95-105ms，电脉冲5-7次。优选的，所述电转的条件为：电压35V，每次脉冲60ms，间隔100ms，电脉冲6次。将胚鼠从母鼠子宫中取出时，连同胎盘一同取出，以延长胎鼠存活时间。一种小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，将上述电转脊髓包埋进入琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后进行切片，将得到的切片贴到微孔膜上进行培养。该方法中的组织切片培养模型非常适合用于外源基因功能研究。在切片时，切下的组织片直接落入预冷的人工脑脊液中。所述人工脑脊液由以下组分组成：NaCl7.371g，KCL0.186g，NaH2PO4·2H2O0.177g，NaHCO31.512g，CaCl20.266g，MgCl2·6H2O0.19g，C6H12O6·H2O2.16g，加入去离子水定容至1L。所述琼脂糖为3.5-4.5％的琼脂糖，优选的为4％的琼脂糖。所述微孔膜的孔径为0.35-0.45μm，优选的为0.4μm。微孔膜的大小约为30mm的正方形，是适合组织生长的悬挂式细胞培养皿膜。0.4μm的孔径可以允许营养物质通过，同时组织片上的细胞可以铺展到膜上进行生长。上述的模型建立方法在探索胚鼠脊髓发育过程中外源基因功能研究中的应用。具体的，将得到的电转脊髓包埋进入琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后进行切片，将得到的切片贴到微孔膜上进行培养，培养后进行固定、染色，通过观察切片上外源基因的异常表达情况来研究外源基因的功能。在实际的培养时，将微孔膜转移到6孔培养板内，在每个培养孔内加1ml组织培养液，在该状态下，培养液刚好与组织片下放接触，但是没有将组织片浸没，保证了组织片下放的细胞能够获得营养，而上方能够充分的暴露在培养液外进行气体的交换，在这种培养条件下保证了组织不会漂浮，同时也保证了组织片不会坏死。更为具体的，电转完成后将脊髓包埋进入4％的琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后将琼脂块裁剪合适大小，并固定在振荡切片机载物台合适的位置上，然后在槽内加入预冷的人工脑脊液，随后按照振幅1.5mm，速度0.5mm/s，切片厚度300μm的条件切片。将切片捞起后贴到0.4μm的微孔膜上，随后将微孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：包括：将含有目的基因的质粒注射到胚鼠离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：包括：将含有目的基因的质粒注射到胚鼠离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。2.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述胚鼠为11-13天的胚鼠。3.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述注射为用显微注射毛细玻璃针通过吹入的方式将所述质粒注射到脊髓腔内。4.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述电转的条件为：电压33-37V，每次脉冲55-65ms，间隔95-105ms，电脉冲5-7次。5.一种小鼠脊髓电转组织切片培...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨慈清，林俊堂，李小英，李栓庆，管丽红，乔梁，李晗，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41