一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法技术

本发明专利技术属于PCSK9抑制剂技术领域，具体涉及一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，包括以下步骤：合适密度肝类细胞的铺板传代，加入待测药物及重组rhPCSK9，之后利用RIPA裂解细胞，取细胞裂解液进行Western blot，检测LDLR含量的变化，同步利用β‑actin蛋白作为内标标定蛋白总量，LDLR的条带灰度值与β‑actin蛋白的条带灰度值比值越大，证明药物对PCSK9的抑制效果越强。本发明专利技术方法通过往细胞中添加重组PCSK9蛋白，找到最佳的添加浓度和作用时间，扩大PCSK9与LDLR的作用窗口，更容易进行PCSK9抑制剂的筛。

A cell based screening method for PCSK9 inhibitors

The invention belongs to the technical field of PCSK9 inhibitors, and specifically relates to a cell-based screening method for PCSK9 inhibitors, which includes the following steps: suitable density of hepatocyte-like cells, paving passage, adding drugs to be tested and recombinant rhPCSK9, then using RIPA to lyse cells, taking cell lysate for Western blot, and detecting the change of LDLR content. The greater the ratio of band gray value of LDLR to that of beta actin protein, the stronger the inhibitory effect of drugs on PCSK9. By adding recombinant PCSK9 protein to cells, the method can find the optimum concentration and action time, expand the interaction window between PCSK9 and LDLR, and screen PCSK9 inhibitors more easily.

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法
本专利技术属于PCSK9抑制剂
，具体涉及一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法。
技术介绍
动脉粥样硬化是心血管系统疾病中最常见的疾病，也是危害人类健康的常见病。动脉粥样硬化的特点是受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变合并存在，包括局部有脂质和复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉着形成斑块，并有动脉中层的逐渐退变，继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成(称为粥样硬化-血栓形成，atherosclerosis-thrombosis)。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。PCSK9是kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员，由692个氨基酸残基组成，主要表达于肝脏、肾脏以及小肠，并且作为一个分泌性蛋白存在于血液中。PCSK9主要在内质网合成，首先形成一个75kDa的前体，其未成熟的前体包含一个N端信号肽序列、一个前结构域、一个催化结构域和一个富含半光氨酸的C端结构域。随后在内质网中PCSK9在其第152位残基处经历一次自动催化性裂解，形成一个14kDa的前结构域片段和一个包含催化结构域和C端结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，细胞的处理S11，传代细胞，收集待测细胞样品；所述细胞为肝类细胞；S12，加药处理利用DMSO或者PBS溶解所述待测细胞样品，加入待测药物和重组rhPCSK9；培养细胞20‑24h，得到加药处理细胞液；其中所述重组rhPCSK9是根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV‑C‑His，得到的真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His；其中所述待测药物为待筛选的PCSK9抑制剂；S2，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，并收集裂解后的上清液；S3，Western‑Blo...

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，细胞的处理S11，传代细胞，收集待测细胞样品；所述细胞为肝类细胞；S12，加药处理利用DMSO或者PBS溶解所述待测细胞样品，加入待测药物和重组rhPCSK9；培养细胞20-24h，得到加药处理细胞液；其中所述重组rhPCSK9是根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到的真核表达载体pCMV-pcsk9-His；其中所述待测药物为待筛选的PCSK9抑制剂；S2，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，并收集裂解后的上清液；S3，Western-Blot检测S2中所得上清液进行上样前处理，处理后上清溶液进行Western-Blot，检测LDLR抗体含量，同时利用β-actin蛋白作为内标标定蛋白总量，比较LDLR抗体和β-actin蛋白的检测结果，LDLR抗体的条带灰度值与β-actin蛋白的条带灰度值比值越大，证明该待测药物对PCSK9的抑制效果越强。2.根据权利要求1所述的基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，其特征在于，所述肝类细胞为HepG2细胞。3.根据权利要求2所述的基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，其特征在于，S12中，所述待测药物为evolocumab，加入evolocumab后使加药处理细胞液中该药物的浓度为50-100nmol/L。4.根据权利要求3所述的基于细胞的PCSK9抑制剂筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰翀，吕志俭，吴敏，毛阳，豆艳丽，闻敏慧，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41