ddx19基因缺失斑马鱼突变体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种斑马鱼ddx19基因缺失突变体的制备方法；包括如下步骤：确定ddx19基因敲除的靶点在斑马鱼ddx19基因第1个外显子上，设计gRNA序列；以pUC19‑‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑ddx19‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；PCR产物进行纯化、体外转录获得gRNA；将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼胚胎一细胞期中，培养获得稳定遗传的ddx19基因突变体。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，获得可稳定遗传的ddx19基因缺失斑马鱼突变体。另外，本发明专利技术还公开了ddx19基因缺失斑马鱼突变体的表型，将为其生物学功能研究以及疾病建模提供基础支持。

Preparation of zebrafish mutant with ddx19 gene deletion

The present invention discloses a preparation method of zebrafish ddx19 gene deletion mutant, including the following steps: determining the target of ddx19 gene knockout at the first exon of ddx19 gene in zebrafish, designing the gRNA sequence; using pUC19 gRNA scaffold plasmid as template, using the primers T7 ddx19 sfd, tracr Rev for PCR amplification; The PCR products were purified and transcribed to obtain gRNA in vitro. The stable inherited mutant of ddx19 gene was obtained by introducing gRNA and Cas9 protein into zebrafish embryos at one-cell stage. The present invention uses CRISPR/Cas9 technology to obtain stable genetic ddx19 gene deletion zebrafish mutant. In addition, the present invention also discloses the phenotype of a zebrafish mutant with ddx19 gene deletion, which will provide basic support for its biological function research and disease modeling.

【技术实现步骤摘要】
ddx19基因缺失斑马鱼突变体的制备方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得ddx19基因缺失斑马鱼突变体的具体方法。
技术介绍
CRISPR/Cas系统属于细菌和古细菌的适应性免疫防御机制。它是在生物不断进化的过程中产生，用来保护自身基因组免受外源核酸的干扰。1987年大阪大学(OsakaUniversity)的研究人员在EscherichiacoliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)和CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgenes，Casgene)。CRISPRRNA(crRNA)以碱基互补的形式引导Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切。根据Cas蛋白的序列和结构将CRISPR/Cas系统分为I型、II型和III型。I和II型CRISPR-Cas系统可以降解外源DNA，而III型CRISPR-Cas系统不仅可以降解外源DNA，还可以降解外源RNA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼ddx19基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定ddx19基因敲除的靶点在斑马鱼ddx19基因第1个外显子上，设计gRNA序列；S2、设计合成gRNA的上游引物T7‑ddx19‑sfd、下游引物tracr rev；S3、以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑ddx19‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，转化获得gRNA；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼ddx19基因突变体。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼ddx19基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定ddx19基因敲除的靶点在斑马鱼ddx19基因第1个外显子上，设计gRNA序列；S2、设计合成gRNA的上游引物T7-ddx19-sfd、下游引物tracrrev；S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板，使用引物T7-ddx19-sfd、tracrrev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，转化获得gRNA；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼ddx19基因突变体。2.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx19基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述靶点的序列为如SEQIDNO.1所示的序列。3.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx19基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述引物T7-ddx19-sfd的序列为如SEQIDNO.2所示的序列。4.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx19基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述引物tracrrev的序列为如SEQIDNO.3所示的序列。5.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx19基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述pUC19-gRNAscaffold质粒模板序列为如SEQIDNO.7所示的序列。6.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx19基因突变体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆华，时灿，岳倩文，李伟明，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31