鼠抗人TIM3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途制造技术

本发明专利技术公开了一种鼠抗人TIM3蛋白的单克隆抗体，能够特异性地识别TIM3蛋白在免疫细胞及肿瘤细胞表面的表达，表现稳定且效价高。本发明专利技术还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明专利技术首次应用免疫组化方法检测TIM3蛋白，为非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌等肿瘤以及脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的临床诊断和治疗方案提供科学参考。首次发现不同杂交瘤细胞产生的单克隆抗体可以识别同一抗原不同修饰状态的TIM3蛋白，利用这一发现可以对TIM3单克隆抗体进行有目的地筛选，具有基础医学研究价值。

【技术实现步骤摘要】
鼠抗人TIM3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
本专利技术涉及免疫学领域，特别涉及一种鼠抗人TIM3蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。
技术介绍
T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域3(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein3，TIM3)是2001年在研究哮喘易感基因的研究中被发现的免疫检查点分子，是Tim家族成员之一，其蛋白结构包括免疫球蛋白样(IgV)区、黏蛋白(mucin)区、跨膜区和胞内区。TIM3在Th1、Tcl、Treg以及NK、树突状细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞和淋巴管内皮细胞均组成性或诱导性表达，而这些细胞是构成肿瘤微环境的主要成分，因此该分子在肿瘤免疫中的作用备受重视。一方面，Th1上的TIM3受其配体半乳糖凝集素-9(Gal-9)激活，提供T细胞负性信号，T细胞逐渐失能成为耗竭性T细胞。耗竭的T细胞逐渐失去增殖能力，同时也逐渐丧失分泌多种细胞因子如IL-2、TNF-α和IFN-γ等的能力。阻断T细胞TIM3信号通路，可有效恢复免疫系统杀伤肿瘤细胞的功能，从而抑制肿瘤生长。另一方面，新近发现高迁移率族蛋白B-1(HMGB-1)和CEACAM-1同样可以作为TIM3的天然配体。TIM3在肿瘤浸润的树突状细胞表面高表达，竞争结合肿瘤细胞碎裂时释放在间质中的HMGB-1，从而抑制抗肿瘤免疫反应。TIM3在抗肿瘤免疫及癌症发展的不同层次发挥重要作用，但遗憾的是目前国内外没有任何一个通过注册的可用于临床体外诊断(InVitroDiagnostics，IVD)用的TIM3抗体。本专利技术研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的抗TIM3蛋白的单克隆抗体，可用于多种实体肿瘤中TIM3蛋白的检测。值得一提的是，在制备本专利技术研制的TIM3单克隆抗体时，首次发现不同杂交瘤细胞产生的单克隆抗体可以识别同一抗原不同修饰状态的TIM3蛋白，利用这一发现可以对TIM3单克隆抗体进行筛选，有目的地获得对于特定研究目标，或用于临床诊断和治疗等特殊性能的单克隆抗体。进一步，该发现将有助于分析TIM3蛋白的修饰与其细胞内位置、功能的联系，对TIM3蛋白不同修饰状态的特异性识别在基础研究领域具有重要的研究价值。在众多激活抗肿瘤免疫的有效策略中，免疫检查点阻断疗法是研究的热门问题之一。近年来，TIM3作为一种新的免疫检查点分子在不同疾病的检测诊断中的研究越来越多，所采用的方法主要是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹实验(WesternBlot)和免疫组化实验(IHC)，其中IHC方法有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等优点而备受重视。本专利技术采用IHC方法，首次建立基于所述TIM3单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌或相关肿瘤，以及包括脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的辅助诊断和治疗方案选择。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗TIM3蛋白的单克隆抗体，及该抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种特异性结合TIM3蛋白的单克隆抗体。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：根据TIM3基因的ORF全序列(Uniprot-Q8TDQ0)，订购基因合成获得TIM3全序列(TIM3核苷酸序列和氨基酸序列分别见序列表)，基因两侧分别引入限制性内切酶位点NheI和XhoI，插入表达载体pDB-His-GST和pDB-His-MBP(加拿大应用生物材料有限公司，AppliedBiologicalMaterialsInc.)，构建TIM3重组表达质粒(T3-pDB-GST和T3-pDB-MBP)。前者T3-pDB-GST用以免疫实验动物，后者T3-pDB-MBP用以ELISA筛选阳性克隆。(2)TIM3重组蛋白的表达与纯化：将T3-pDB-GST重组表达质粒转化BL21DE3Star感受态细胞，裂解细胞后离心取上清，Nickel柱纯化，获得纯化的TIM3重组蛋白；(3)单抗的筛选与制备：采用上述纯化的T3-pDB-GST重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用T3-pDB-MBP预铺的96孔板采用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗TIM3特异性抗体的杂交瘤细胞株；制备小鼠腹水，通过proteinA柱层析纯化TIM3单抗。分别通过免疫组化实验(结果见图1)和WesternBlot(结果见图2)验证该单抗的灵敏度和特异性。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化工具中的应用。所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测多种实体肿瘤中的应用。由于TIM3蛋白的异常表达或扩增与人类多种恶性肿瘤有关，因此使用本专利技术单克隆抗体检测细胞中TIM3蛋白的表达或扩增状况，可用于辅助诊断TIM3相关性肿瘤。更主要的是，TIM3在免疫细胞中的高表达将导致机体抗肿瘤免疫功能下降，因此检测TIM3在免疫细胞表面的表达对于分析机体抗肿瘤反应和选择适当的免疫检查点抑制剂治疗具有重要的指导作用。以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该TIM3单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：(1)使用机器自带的IHCprotocolF，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；(2)抗体使用终浓度为0.2μg/ml，室温孵育30min；(3)抗原修复使用pH9.0的抗原修复液(ER2)，100℃加热孵育20min。使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。本专利技术所述针对TIM3的特异性单抗，可与TIM3蛋白特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌或相关肿瘤，以及包括脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的辅助诊断和治疗方案选择。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1为以本专利技术单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测肺癌组织中TIM3蛋白的表达染色图；图2为本专利技术单克隆抗体的WesternBlot结果：两个泳道的上样样品均为同一转染TIM3基因的CHO-K1细胞裂解液，由左向右依次为使用本专利技术TIM3单克隆抗体检测的结果和使用β-Actin抗体检测的阳性对照的结果。图3为应用TIM3抗体的12个不同单克隆检测同一细胞裂解物的WesternBlot结果：1、3-8号克隆显示两条谱带，大小分别约为30kD和50kD；2号克隆显示单一谱带，大小约为30kD；9-12号克隆显示单一谱带，大小约为50kD；+ve为阳性对照；-ve为阴性对照。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1抗TIM3单克隆抗体的制备一、TIM3重组表达质粒的构建根据uniprot报道的TIM3基因(Uniprot-Q8TDQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人TIM3蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人TIM3蛋白。2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化检测工具中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测TIM3蛋白的内容包括不同修饰状态的TIM3蛋白。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可以用于临床诊断与辅助治疗方案选择及医学基础研究。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，来源于同一TIM3抗原的不同TIM3单克隆抗体，可以特异性地识别具有不同修饰状态的TIM3蛋白，据此可以获得对于特定研究目标，或用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军，李雪，方洁羽，高源远，威尔逊王，李沛祥，
申请(专利权)人：镇江爱必梦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32