凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了凡德他尼(dasatinib)在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用，属于医药技术领域。本发明专利技术通过实验验证凡德他尼的上述应用，分子对接法、SPR法和MST实验结果表明凡德他尼能够与EphB4相互作用。EphB4激酶实验显示，凡德他尼可明显抑制EphB4激酶活性。显著抑制白血病细胞K562，JLTRG，H9的增殖。同时，凡德他尼显著抑制EphB4下游的信号分子p‑PI3K p85/p55、PI3K p85表达，下调MEK和ERK的磷酸化水平。因此，本发明专利技术的实验结果充分支持凡德他尼在抗白血病药物和靶向EphB4的肿瘤药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
白血病是血液系统一种常见的恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。白血病是造血干细胞异常克隆性疾病，具有高度异质性。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。按起病的缓急可分为急、慢性白血病。临床上常将白血病分为淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病等。Eph属于已知最大的RTKs亚族，包括Eph受体及其Ephrin配体。EphB4与EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式，可互被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”，EphB4/ephrinB2及其独特的双向信号转导调控癌症的增殖、转移和侵袭等。EphB4基本在所有的肿瘤中表达，但目前并没有靶向于EphB4的药物面市。凡德他尼Vandetanib，分子式C22H24BrFN4O2，白色，圆，双凹，薄膜包衣。凡德他尼属小分子多酪氨酸激酶抑制剂，属苯胺喹唑啉类化合物，不仅作用于肿瘤细胞的EGFR、VEGFR和RET酪氨酸激酶，还可抑制其他酪氨酸激酶以及丝氨酸/苏氨酸激酶。凡德他尼是第一个批准的髓样甲状腺癌治疗药物，适用于治疗不能切除、局部晚期或转移的有症状或进展的髓样甲状腺癌。目前尚无凡德他尼抗白血病以及靶向EphB4的肿瘤的应用报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述的药物为抑制EphB4表达的药物。优选地，所述的药物为通过抑制肿瘤细胞EphB4的表达进而调控其信号通路的药物。更进一步优选地，所述的药物为抑制EphB4下游的信号分子p-PI3Kp85/p55、PI3Kp85表达，且下调MEK和ERK的磷酸化水平的药物。优选地，所述的肿瘤为白血病。优选地，所述的药物为抑制白血病细胞K562、JLTRG或H9增殖的药物。优选地，凡德他尼的动物给药量为10～80mg/kg。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开了凡德他尼(dasatinib)在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。本专利技术通过实验验证凡德他尼的上述应用，分子对接法、SPR法和MST实验结果表明凡德他尼能够与EphB4相互作用。EphB4激酶实验显示，凡德他尼可明显抑制EphB4激酶活性。进一步地，通过MTT实验显示凡德他尼能够显著抑制白血病细胞K562，JLTRG，H9的增殖，尤其对EphB4表达量高的K562细胞抑制作用更为明显。通过siRNA干扰敲低K562细胞的EphB4后，凡德他尼对K562细胞的抑制作用明显减弱；而过表达K562细胞的EphB4后，凡德他尼对K562细胞的抑制作用明显增强。在静脉注射K562细胞的裸鼠实验中，凡德他尼经灌胃给药14天后，进行取血，测定EphB4的表达。凡德他尼可明显降低体内EphB4的含量。更进一步地，凡德他尼显著抑制EphB4下游的信号分子p-PI3Kp85/p55,PI3Kp85表达，下调MEK和ERK的磷酸化水平。因此，本专利技术的实验结果充分支持凡德他尼(dasatinib)在抗白血病药物和靶向EphB4的肿瘤药物中的应用。附图说明图1：K562，JLTRG，H9白血病细胞中EphB4含量。A：细胞蛋白条带图；B：A图定量图；图2：凡德他尼作用不同时间后对K562和H9细胞的生长抑制作用；图3：凡德他尼对EphB4激酶活性的影响；图4：凡德他尼与EphB4蛋白相互作用SPR分析；A：凡德他尼与EphB4胞内蛋白SPR结合曲线；B：凡德他尼与EphB4胞外蛋白SPR结合曲线；图5：siRNA干扰EphB4实验结果；A：基因干扰后蛋白表达图；B：A图定量图；C：基因干扰后mRNA表达图；D：凡德他尼作用wildtype与EphB4knockdownK562细胞后抑制率统计图；图6：K562和H9瞬时转染EphB4实验结果；A：瞬时转染后蛋白表达图；B：A图定量图；C：瞬时转染后mRNA表达图；D：凡德他尼作用wildtype与EphB4transfectedK562细胞后抑制率统计图；E：凡德他尼作用wildtype与EphB4transfectedH9细胞后抑制率统计图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。实施例1免疫印迹法测定EphB4表达：免疫印迹法考察三种不同类型白血病细胞的EphB4表达水平。待细胞处于指数生长期时，用RIPA细胞裂解液将细胞进行裂解30min，使用冷冻离心机12000g、10min、4℃将细胞裂解液进行离心沉淀。吸取上清液并加入一定量的5×上样缓冲液，加热煮沸5min使蛋白变性，标记，放置于-20℃备用。将处理好的蛋白样品在配制好的10％SDS-PAGE上进行上样，加入1×电泳缓冲液，开通电源，保持120mV稳压进行样品分离。将分离好的样品进行有目的的切割，并将其使用120mA稳流进行转膜过程。转膜结束后将PVDF膜放入脱脂奶粉封闭液中进行封闭2h。之后孵育EphB4一抗，并让其在4℃孵育过夜。将膜用TBST进行清洗3次，每次10min，再孵育二抗，使其反应1h。再将膜用TBST进行清洗3次，每次10min。最后加入发光液进行显影。结果参见图1，结果表明K562，JLTRG，H9三株不同的白血病细胞中EphB4表达水平各异，K562>JLTRG>H9。细胞增殖实验：采用MTT法考察凡德他尼对K562，JLTRG，H9的生长抑制作用进行考察。将指数生长期的细胞以每孔2×104个细胞的浓度混悬于完全培养基中并以每孔180μL的体积接种于96孔板中。待其生长24h之后，以每孔20μL体积加入到96孔板中。待其反应48h后，加入20μL的MTT(5mg/mL)于96孔板中。使其在37℃中反应4h，使用离心机(1000r/min)离心5min，再使用移液器将96孔板中液体吸干净，并加入150μLDMSO到96孔板中，在摇床上使其充分混匀。最后在酶联免疫检测仪中选用490nm处进行检测并读数。结果显示K562对凡德他尼作用的敏感性最强，且IC50值最低，H9细胞EphB4表达量最低，IC50值最高。凡德他尼分别作用白血病细胞K562和H924h，48h，72h后，结果参见图2，MTT结果显示随着药物作用时间的增加，K562和H9的敏感性也逐渐增加，IC50值减小，即凡德他尼对K562和H9的细胞增殖抑制作用且呈现剂量与时间依赖性。实施例2激酶实验考察凡德他尼对EphB4激酶活性的影响：采用均匀时间分辨荧光(HTRF)方法检测药物抑制EphB4激酶的磷酸化的作用。在384孔板中分别加入2μLEphB4激酶和2μL底物，再在其中加入4μL不同浓度的凡德他尼，最后再加入2μLATP于384孔板中，使用甩板机使反应体系混合均匀，这时将384孔板放入37℃烘箱进行孵育。待反应30min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.凡德他尼在制备靶向EphB4的抗肿瘤药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制EphB4表达的药物。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过抑制肿瘤细胞EphB4的表达进而调控其信号通路的药物。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制EphB4下游的信号分子p-PI3Kp...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦民，马维娜，朱曼，代秉玲，张东东，崔宇鑫，龚政艳，杨柳，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61