本发明专利技术涉及免疫学领域，具体公开了一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒。本发明专利技术通过人工合成如SEQ ID NO.1所示的多肽，并以此为抗原，包被固相载体，以实现牛流产衣原体的酶联免疫吸附检测。本发明专利技术以该人工合成的多肽抗原作为包被抗原，使酶联免疫吸附检测具有特异性高、灵敏性好的特点。本发明专利技术还在抗原包被固相载体后，提供了优化的抗原保护剂，对包被好的抗原进行保护，延长了抗原的保存时间。
【技术实现步骤摘要】
一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒
本专利技术涉及免疫学领域，具体地说，涉及酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒。
技术介绍
牛流产衣原体病(Bovinechlamydiaabortus)是由流产衣原体(Chlamydophilaabortus)引起的一类牛羊等哺乳动物和猪流产的人畜共患传染性疾病。发病奶牛感染此病主要表现为流产、生殖能力减退、产死胎、流产后胎衣不下；同时伴有产奶量下降，食欲减退，部分病牛有体温升高、精神萎靡等症状。另外有实验证实奶牛子宫内接种流产衣原体病原可引起奶牛乳腺炎。种公牛感染了流产衣原体，病原进入精液里可引起种牛繁殖能力下降。人类在接触或处理流产胎儿或小牛时不采取得当的保护措施就很容易引起感染，人感染后主要出现流感样症状，怀孕妇女感染此病原很容易引起流产。目前国内外对流产衣原体的主要检测手段包括两大类即抗原检测和血清学检测。抗原检测方法有：1)胎盘组织或阴道棉拭子涂片直接染色、免疫组织化学染色。直接染色病原法方法操作简单、检测快，但是灵敏性和特异性一般。免疫组织化学染色方法操作比较复杂并且上述两种方法结果判定都需要有丰富的专业技术经验，判定结果受主观影响较大，尤其辨认衣原体的EB和RB时候相当困难。2)病原分离鉴定方法细胞培养分离病原对衣原体包涵体进行免疫组织化学或免疫学染色，需要禽胚或细胞，分离过程比较复杂并对试验操作、实验环境和实验设施要求较高一般基层试验室难以进行。3)免疫荧光抗体技术其优点是方法简便、特异性强、非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低、荧光显微镜价格昂贵不适合作为常规检测方法。4)聚合酶链反应虽然有较高的特异性和敏感性制备模板比较复杂所需样本量大，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。5)双抗夹心酶联免疫吸附试验方法具有简便，灵敏，高效等特点但目前国内没有能够检测流产衣原体抗原的ELISA试剂盒。相对于抗原检测方法，检测抗体方法为比较简便易行。比如免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、补体结合试验以及胶体金试剂条检测试验等。1)免疫荧光试验用标记的已知衣原体抗原检测特异性抗体，此方法优点简单易行、特异性高。缺点为灵敏度偏低、所用设备昂贵。2)酶联免疫吸附试验有操作简便、特异性和灵敏度高、对操作人员的技术要求不高、实验结果受主观因素影响小等优点而被广泛应用于临床检测血清抗体技术中，但目前国内市场上没有针对流产衣原体抗体的酶联免疫吸附试剂盒。3)间接血凝试验方法操作程序简单、不需要特殊设备，但是结果判定受主观因素影响较大，而且耦合抗原多为全菌体，可能与部分革兰氏阴性菌存在交叉反应，结果易产生假阳性。4)补体结合试验方法被广泛应用于兽医实验室。但补体结合试验操作繁琐、敏感性低、检测时间长、需要较高的专业知识以及容易与其他革兰氏阴性菌血清产生交叉反应等缺陷在临床应用中受到较多限制。5)胶体金试纸条法操作简单易行但检测敏感性较低。目前国内市场流通的检测衣原体抗体试剂盒都以衣原体全菌体和纯化的衣原体脂多糖作为抗原。然而，由于这些抗原的主要成分为衣原体主要外膜蛋白(MOMP)和脂多糖，是最常见的衣原体交叉反应的抗原容易引起交叉反，只能局限于鉴定衣原体抗原而不能够分别不同种属的衣原体，即无法特异性检测牛流产衣原体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒，通过高特异性地检测牛流产衣原体抗体，实现对牛流产衣原体的间接酶联免疫检测。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒，所述试剂盒中的固相载体上包被有如SEQIDNO.1所示的多肽。所述多肽序列来自于流产衣原体S26/3株的POMP90蛋白的一段多肽序列。多肽序列可委托商业公司完成合成，本专利技术实施例中所使用的多肽片段由北京中科亚光生物科技有限公司合成。进一步地，所述固相载体包被所述多肽后，采用抗原保护剂进行处理；所述抗原保护剂为含有10％蔗糖、10％甘油的PBS，优选pH值为7.2。更进一步地，所述固相载体为酶标板，如96孔酶标板，所述酶标板的制备方法为：1)利用无菌去离子水将所述多肽稀释成多肽溶液；2)利用碳酸盐缓冲液将步骤1)所得的多肽溶液稀释1000倍，加入酶标板各孔孵育，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板后，使用封闭液进行封闭；3)向封闭好的微孔板每孔加入所述抗原保护剂孵育，倒掉抗原保护剂，洗涤，晾干，即得；优选利用无菌去离子水将所述多肽稀释成终浓度为1mg/mL的多肽溶液；优选利用碳酸盐缓冲液将步骤1)所得的多肽溶液稀释为终浓度为1.0μg/mL的多肽溶液；优选所述碳酸盐缓冲液为pH9.6、50mM的碳酸盐缓冲液；优选所述封闭液为含10％脱脂奶粉的PBST溶液。作为优选，所述终浓度为1.0μg/mL的多肽溶液加入酶标板各孔后，在4℃孵育16小时；使用所述封闭液在37℃孵育2小时封闭；加入所述抗原保护剂后，在37℃孵育4小时。将上述优选方案组合，得到如下酶标板的制备方法：1)利用无菌去离子水将所述多肽稀释成终浓度为1mg/mL的多肽溶液；2)利用pH9.6、50mM的碳酸盐缓冲液将步骤1)所得的多肽溶液稀释为终浓度为1.0μg/mL的多肽溶液，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含10％脱脂奶粉的PBST溶液)封闭，以封闭液100μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干；3)封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，37℃孵育2小时后，倒掉抗原保护剂，洗涤，甩干，紫外照射1小时，获得包被有所述多肽(流产衣原体S26/3株POMP90蛋白)的酶标板。进一步地，所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照血清和阳性对照血清；所述阳性对照血清的制备方法具体如下：1)取流产衣原体S26/3株POMP90蛋白KLH-偶联肽(由SEQID多NO.1所示多肽偶联KLH载体蛋白而成，多肽偶联委托上海强耀生物科技有限公司完成)，将抗原以10mmol/LPBS缓冲液(pH7.4)稀释至浓度为20mg/mL作为免疫抗原；其中，PBS缓冲液为氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠(12H2O)3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶解于900mL去离子水中，充分溶解后，以1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，加去离子水定容至1L所得；2)选择2头4月龄，衣原体抗体为阴性小牛，进行免疫；3)首免：将氟氏完全佐剂与免疫抗原等量混合，充分乳化，取2mL颈部皮下多点注射；4)二免：首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与免疫抗原等量混合，充分乳化，取2mL颈部皮下多点注射；5)三免：二免后第7天，同二免方法加强免疫一次；6)四免：三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射免疫抗原2mL；7)1周后尾静脉采血，分离血清并稀释，采用SEQIDNO.1所示的流产衣原体S26/3株pomp90蛋白多肽包被的酶标板ELISA方法检测其免疫血清抗体效价，选取1:200稀释时OD450值大于1.0的小牛，进行颈静脉采血，无菌分离血清，水浴灭活，即获得流产衣原体阳性对照血清(流产衣原体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的固相载体上包被有如SEQ ID NO.1所示的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的固相载体上包被有如SEQIDNO.1所示的多肽。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包被所述多肽后，采用抗原保护剂进行处理；所述抗原保护剂为含有10％蔗糖、10％甘油的PBS，优选抗原保护剂的pH值为7.2。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板，所述酶标板的制备方法为：1)利用无菌去离子水将所述多肽稀释成多肽溶液；2)利用碳酸盐缓冲液将步骤1)所得的多肽溶液稀释1000倍，加入酶标板各孔孵育，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板后，使用封闭液进行封闭；3)向封闭好的微孔板每孔加入所述抗原保护剂孵育，倒掉抗原保护剂，洗涤，晾干，即得；优选利用无菌去离子水将所述多肽稀释成终浓度为1mg/mL的多肽溶液；优选利用碳酸盐缓冲液将步骤1)所得的多肽溶液稀释为终浓度为1.0μg/mL的多肽溶液；优选所述碳酸盐缓冲液为pH9.6、50mM的碳酸盐缓冲液；优选所述封闭液为含10％脱脂奶粉的PBST溶液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板的制备方法为：所述终浓度为1.0μg/mL的多肽溶液加入酶标板各孔后，在4℃孵育16小时；使用所述封闭液在37℃孵育2小时封闭；加入所述抗原保护剂后，在37℃孵育4小时。5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照血清和阳性对照血清；所述阳性对照血清的制备方法为：将SEQIDNO.1所示的多肽偶联KLH载体蛋白获得偶联肽，以10mmol/LPBS缓冲液(pH7.4)稀释至浓度为20mg/mL作为免疫抗原...
【专利技术属性】
技术研发人员：何诚，王艺晖，郭永霞，李顺琴，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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