一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法。该方法通过引入能够与目标蛋白紧密结合的目标蛋白抗体与在大肠杆菌体内通过BirA蛋白催化而被生物素修饰的不同数量bap肽段的融合蛋白，将生物素‑亲和素系统与抗原‑抗体相互作用连接起来，从而实现基于生物素‑亲和素系统的不同级数的放大。实验证明，采用本发明专利技术提供的方法可检测待测样本中目标蛋白的含量，还能够根据目标蛋白的浓度调整融合蛋白的种类、比例、浓度来满足不同的检测需求。本发明专利技术具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法
本专利技术涉及免疫生物工程
，具体涉及一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法。
技术介绍
随着对微量物质检测技术的需求的日益增长，信号放大系统的研究也在逐渐升温。目前信号放大系统主要包括传统ELISA技术、无机纳米纤维技术、金属微粒技术、自组装蛋白纤维技术等等。架构信号放大系统的目的是为了使得微量的物质通过每级分子与前一级分子之间的相互作用，极弱的信号一级级地放大到可以被检测的强度。ELISA技术专利技术于上世纪60年代，在70年代和80年代开始发展并使用，是从抗原定位的酶标抗体技术发展成的液体标本中微量物质的检测方法，广泛地应用于临床鉴定、环境监测、质量评估、精度分析等方面。其基本原理是借助了抗原与抗体之间的特异性结合，完成一级级的信号放大，通过酶对底物的作用生成与之前不同颜色的产物且颜色强度与酶量在一定浓度范围内正相关，使得可以借助颜色的深浅来量化信号的强弱。蛋白G是C群和G群链球菌中发现的一种IgG结合蛋白，拥有重复的结构域，其对哺乳类动物的单克隆和多克隆IgG的Fc区有着特异性高的亲和力。与同样功能的蛋白A相比，蛋白G对于大多数哺乳动物的IgG，尤其是对于IgG的亚基的亲和力更强。GB3M也是蛋白G的一种。bap肽段是能被生物素标记的最短长度的共有肽段模型。它来源于BCCP所在的能被生物素标记的同源序列肽段库。BCCP是乙酰辅酶A羧化酶的一个亚基，在大肠杆菌中可被BirA蛋白催化使得其与生物素共价结合。其氨基酸序列在不同物种中具有一定同源性，尤其是被生物素标记的赖氨酸位点。通过在库中选取最接近于共有肽段模型的序列，并对其截短突变体性质进行检测，得到保留被生物素标记这一功能的最短长度的肽段——bap肽段。生物素易与生物大分子共价结合，作为常用标记广泛应用于各类检测系统中。亲和素是一种与生物素分子有强亲和作用的蛋白，常用的主要为两种：一是来源于Streptomycesavidinii的链霉亲和素，是大小为66kD的四聚体蛋白；二是被发现存在于鸡蛋卵白的卵白亲和素，是大小为60kD的四亚基蛋白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题如何检测待测样本中目标蛋白的含量。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：所述步骤(a)可包括如下步骤：(a-1)复合物和待测样本混匀，孵育；(a-2)完成步骤(a-1)后，采用化合物A检测荧光信号值；所述步骤(b)可包括如下步骤：(b-1)所述复合物和目标蛋白标准溶液混匀，孵育；(b-2)完成步骤(b-1)后，采用所述化合物A检测荧光信号值；所述步骤(c)：根据所述目标蛋白标准溶液中目标蛋白的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤(a-2)得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标蛋白的含量；所述复合物可为一个末端连接目标蛋白抗体、另一个末端连接化合物B的特异肽段；所述特异肽段可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)bap1肽段；a2)bap2肽段；a3)bap5肽段；a4)bap10肽段；所述bap1肽段可为氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第222至238位所示的肽段；所述bap2肽段可为氨基酸序列是序列表中序列6自N端起第222至263位所示的肽段；所述bap5肽段可为氨基酸序列是序列表中序列9自N端起第222至338位所示的肽段；所述bap2肽段可为氨基酸序列是序列表中序列12自N端起第222至463位所示的肽段；所述化合物B可与所述化合物A结合。上述方法中，所述化合物B可为生物素。所述化合物A可为亲和素。所述亲和素可为卵白亲和素。所述卵白亲和素可为avidin-HRP(BioLegend公司的产品，产品目录号为405103)。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测待测样本中目标蛋白的含量的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒具体可为试剂盒甲，可包括上述任一所述复合物和所述化合物A。所述试剂盒甲还可包括目标蛋白标准溶液。本专利技术所提供的试剂盒具体可为试剂盒乙，可包括上述任一所述目标蛋白抗体、所述化合物B、所述化合物A和所述特异肽段。所述试剂盒乙还可包括目标蛋白标准溶液。所述试剂盒甲或所述试剂盒乙在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述复合物在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述复合物也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述特异肽段在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述bap1肽段的编码基因、或含有上述任一所述bap1肽段的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述bap1肽段的编码基因如序列表中序列2自5’末端起第664至717位所示。上述任一所述bap2肽段的编码基因如序列表中序列5自5’末端起第664至792位所示。上述任一所述bap5肽段的编码基因如序列表中序列8自5’末端起第664至1017位所示。上述任一所述bap10肽段的编码基因如序列表中序列11自5’末端起第664至1392位所示。在本专利技术的一个实施例中，所述目标蛋白为抗体分子lgG。抗体分子lgG的抗体为GB3M蛋白。所述GB3M蛋白可为b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第22至219位所示的蛋白质；b2)氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第22至219位所示的蛋白质；b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。当待测目标蛋白为抗体分子lgG时，所述复合物可为c1)或c2)或c3)或c4)：c1)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap1肽段；c2)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap2肽段；c3)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap5肽段；c4)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap10肽段。所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap1的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap1可为氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质。所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap2的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap2可为氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质。所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap5的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap5可为氨基酸序列是序列表中序列12所示的蛋白质。所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap10的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap10可为氨基酸序列是序列表中序列15所示的蛋白质。所述复合物的制备方法为：将编码融合蛋白(融合蛋白GB3M-bap1、融合蛋白GB3M-bap2、融合蛋白GB3M-bap5或融合蛋白GB3M-bap10)的基因和编码BirA蛋白的基因导入大肠杆菌，然后将该大肠杆菌在含生物素的培养基中表达(需乳糖诱导)，纯化，进一步得到复合物。所述“将编码融合蛋白(融合蛋白GB3M-bap1、融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法，包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：所述步骤(a)包括如下步骤：(a‑1)复合物和待测样本混匀，孵育；(a‑2)完成步骤(a‑1)后，采用化合物A检测荧光信号值；所述步骤(b)包括如下步骤：(b‑1)所述复合物和目标蛋白标准溶液混匀，孵育；(b‑2)完成步骤(b‑1)后，采用所述化合物A检测荧光信号值；所述步骤(c)：根据所述目标蛋白标准溶液中目标蛋白的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤(a‑2)得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标蛋白的含量；所述复合物为一个末端连接目标蛋白抗体、另一个末端连接化合物B的特异肽段；所述特异肽段为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)bap1肽段；a2)bap2肽段；a3)bap5肽段；a4)bap10肽段；所述bap1肽段为氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第222至238位所示的肽段；所述bap2肽段为氨基酸序列是序列表中序列6自N端起第222至263位所示的肽段；所述bap5肽段为氨基酸序列是序列表中序列9自N端起第222至338位所示的肽段；所述bap2肽段为氨基酸序列是序列表中序列12自N端起第222至463位所示的肽段；所述化合物B可与所述化合物A结合。...

【技术特征摘要】
1.一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法，包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：所述步骤(a)包括如下步骤：(a-1)复合物和待测样本混匀，孵育；(a-2)完成步骤(a-1)后，采用化合物A检测荧光信号值；所述步骤(b)包括如下步骤：(b-1)所述复合物和目标蛋白标准溶液混匀，孵育；(b-2)完成步骤(b-1)后，采用所述化合物A检测荧光信号值；所述步骤(c)：根据所述目标蛋白标准溶液中目标蛋白的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤(a-2)得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标蛋白的含量；所述复合物为一个末端连接目标蛋白抗体、另一个末端连接化合物B的特异肽段；所述特异肽段为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)bap1肽段；a2)bap2肽段；a3)bap5肽段；a4)bap10肽段；所述bap1肽段为氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第222至238位所示的肽段；所述bap2肽段为氨基酸序列是序列表中序列6自N端起第222至263位所示的肽段；所述bap5肽段为氨基酸序列是序列表中序列9...

【专利技术属性】
技术研发人员：于瑶，韩剑，林白雪，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京,11