一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公布了一种万古霉素的化学发光酶联疫检测试剂盒，属于酶联免疫吸附分析技术领域。所述的试剂盒中的组分包括：包被有万古霉素包被抗原的化学发光板；万古霉素特异性抗体；酶标二抗；万古霉素标准品溶液；磷酸盐缓冲液；洗涤液；底物显色液。本发明专利技术的化学发光酶联免疫试剂盒利用万古霉素多克隆抗体进行免疫检测，灵敏度IC50＝143.94ng/mL，在血浆中回收率为93.92～106.90％之间，变异系数小于15.07％。本发明专利技术的化学发光酶联免疫试剂盒检验方法简便易行，具有特异性强，灵敏度高，准确度高等特点，将在临床中实时监测万古霉素血药浓度发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测血浆中万古霉素含量的化学发光酶联免疫检测试剂盒，属于药品的检测分析
背景资料万古霉素(Vancomycin)，其分子量为1449.26，是通过放线菌属的东方拟无枝酸菌发酵产生，是三环糖苷化非核糖体肽的一种分支产物，属于抗生素的一种，其作用机制是抑制革兰氏阳性菌细胞壁中的磷脂和多肽的合成而使细菌无法生存，该药对耐青霉素葡萄球菌具有极强的作用效果，是对抗革兰阳性菌最有力的抗生素之一。现主要用于耐药菌感染的治疗，也用在难辨梭菌酿成的抗生素耐药性的伪膜性肠炎的治疗，及抵抗“超级细菌”的终极防线。万古霉素具有良好的抗菌效果，但其通常不作为一线药物应用，主要原因是由于其治疗窗狭窄，一般认为谷浓度高于15μg/mL，峰浓度超过80μg/mL为中毒范畴，会引起一定的不良反应。不良反应包括肾损害严重，耳毒性，有时伴有荨麻疹等过敏现象。当前用于检测万古霉素血药浓度的手段主要有高效液相色谱法，微生物分析法及免疫分析法。高效液相色谱法需要专业人士操作，操作相对繁琐耗时，而且仪器、试剂、耗材及后期维护等费用相对较高，不利于高通量监测万古霉素的血药浓度，尤其是在欠发达地区，应用受限。微生物分析法灵敏度高，但存在操作复杂、耗时长等局限性，需要进行改良，简化实验步骤，缩短实验周期。免疫分析法，包括放射性免疫分析法及荧光偏振免疫分析法。其中放射免疫分析是以放射性同位素为标记物的免疫分析方法，该法因存在放射性污染等不足而逐渐被取代。而荧光偏振免疫分析法检出限一般在0.1-10ng之间，灵敏度较其他免疫分析法较低且合成的tracer具有选择性较低等缺点。化学发光酶联免疫分析法作为一种新型有效的检测，近年来获得了迅速的发展，已广泛应用到食品，环境及药品领域当中。化学发光酶免疫分析法是建立在酶联免疫分析法基础上，利用化学发光强度与抗原抗体特异性反应结合而建立起来的分析方法，具有灵敏度高且及线性范围宽等优点。基于抗原-抗体反应，省去了样品冗长而繁琐的前处理过程，更适于成分较为复杂难于分离处理的样品检测。化学发光酶免疫分析法运用到各个领域中，包括医疗领域，食品安全，环保问题等。化学发光酶免疫分析法体系中一般采用的是鲁米诺-双氧水-辣根过氧化物酶(HRP)/碱性磷酸酯酶(ALP)发光系统[39]，并且采用对碘苯酚(PIP)作为发光增强剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决传统检测方法存在的不足，提供一种操作简便，费用低廉，灵敏度高，能够现场监控且适合大量样本筛查的，用于检测血浆中万古霉素含量的化学发光酶联免疫检测试剂盒及方法。本研究在获得完全抗原，制备万古霉素特异性抗体的基础上，建立了针对万古霉素的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法，用于定量检测血浆中万古霉素的含量，结果表明该方法简便，快速，特异性强，灵敏度高。本专利技术的检测原理为：当在微孔条上预包被生物素包被抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入万古霉素特异性抗体溶液，样本中的万古霉素或万古霉素标准品与微孔中包被的万古霉素包被抗原竞争万古霉素特异性抗体，加入酶标二抗进行放大作用，用显色液显色，样本发光值与样本中万古霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中万古霉素的含量。本专利技术提供的万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒中的试剂组成包括：包被有万古霉素包被抗原的化学发光板；万古霉素特异性抗体；酶标二抗；万古霉素标准品溶液；磷酸盐缓冲液；洗涤液；底物显色液。其中：所述的万古霉素包被抗原是将万古霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到的，万古霉素包被抗原的浓度为0.25～0.5μg/mL。所述的万古霉素特异性抗体是由万古霉素与分子量范围在6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述的生物素特异性抗体的工作浓度为1∶20000。所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，工作浓度为1∶10000。所述的万古霉素标准品溶液的浓度依次为0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10000ng/mL，100000ng/mL。所述的磷酸盐缓冲液是8gNaCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKCl，0.2gKH2PO4溶于1000mL蒸馏水中制得的水溶液。所述的洗涤液是含有体积分数0.05％吐温20的pH为7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液。所述的底物显色液包括显色液A，显色液B和显色液C。显色液A为pH为8.5的对碘苯酚溶液，显色液B为pH为8.5的鲁米诺溶液，显色液C为0.01％(v/v)的双氧水溶液。使用时显色液A，B，C的使用体积比为1∶1∶2。本专利技术提供的化学发光酶联免疫试剂盒用于血浆中万古霉素含量的检测。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术中检测血浆中万古霉素的化学发光酶联免疫试剂盒采用间接竞争法定性或定量检测血浆中万古霉素的含量，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。本专利技术采用高特异性的万古霉素多克隆抗体，检验方法简便易行，具有特异性高，灵敏度高，准确度高等特点，将在血浆中万古霉素含量的检测中发挥重要作用。附图说明图1为本专利技术万古霉素抗体的抑制率曲线。图2为本专利技术万古霉素的化学发光酶联免疫试剂盒的工作曲线。下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。具体实施方式实施例1，试剂盒关键组分的制备免疫原的合成A、准确称取29.838mg的万古霉素，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液中；B、磁力搅拌下，滴入1mL新鲜配制的0.1mol/L的NalO4的水溶液。将反应器用锡箔纸避光，在室温条件下反应1小时，得到“a”液；C、用5％的K2CO3溶液调节“a”液的pH值，将pH值调节至9.5；D、准确称取40mg牛血清白蛋白(cBSA)，溶解于6mL的磷酸盐缓冲溶液中，得到“b”液；E、将“a”液缓慢逐滴滴入至“b”液中，并实时监测溶液的pH值，用5％的K2CO3调节反应液的pH在9.0左右，注意滴加速度一定要缓慢。反应在室温条件下，封闭避光反应1小时，最终得到黄色澄清溶液；F、将所得黄色澄清溶液转移至透析袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析3天，再于蒸馏水中透析3天，透析过程中每6-8小时更换一次透析液，均在4℃下进行。G、冷冻干燥所得透析产物，于-20℃冷冻封存备用。万古霉素宝贝抗原的合成将万古霉素和卵清蛋白(OVA)采用高碘酸钠氧化法进行偶联得到包被抗原，具体步骤与免疫原合成相似，仅用OVA代替BSA进行偶联。万古霉素特异性抗体的制备采用雄性新西兰大白兔作为免疫动物，以万古霉素与牛血清蛋白的偶联物为免疫原。本实验采用的微量长程免疫法，共免疫5次。因为采用研磨法将免疫原与佐剂充分混合，研磨过程中会有损耗，故免疫原与佐剂剂量同时加倍。首次免疫采用的是免疫原溶液与佐剂溶液等体积混合，即称取2mg的免疫原溶于2mL生理盐水中，之后与2mL的弗氏完全佐剂充分混合，将混合溶液注射入动物体内进行免疫(每只兔子免疫剂量为1mL，浓度为0.5mg/mL)。接下来四次免疫均为加强免疫，避免由于免疫反应过强而导致动物致死，之后三次免疫原剂量减半且免疫佐剂采用弗氏不完全佐剂，即1mg免疫原溶于2mL生理盐水中，再与2mL弗氏不完全佐剂混合(每只兔子免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂的组成包括：(1)包被有万古霉素包被抗原的化学发光板；(2)万古霉素特异性抗体；(3)酶标二抗；(4)万古霉素标准品溶液；(5)磷酸盐缓中液；(6)洗涤液；(7)底物显色液。

【技术特征摘要】
1.一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂的组成包括：(1)包被有万古霉素包被抗原的化学发光板；(2)万古霉素特异性抗体；(3)酶标二抗；(4)万古霉素标准品溶液；(5)磷酸盐缓中液；(6)洗涤液；(7)底物显色液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的化学发光板中包被的万古霉素包被抗原是将万古霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到的；所述的万古霉素包被抗原的浓度为0.25～0.5μg/mL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的万古霉素特异性抗体是由万古霉素与分子量范围在6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述的生物素特异性抗体的工作浓度为1∶20000。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，工作浓度为1∶10000。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的万古霉素...

【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，董亚庆，刘玮，尹永梅，孟萌，王玉芬，宋兆瑞，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12