一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一株产褐藻胶裂解酶的约氏黄杆菌，属于生物技术领域。本发明专利技术从土壤及河水样品中分离出约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX‑11，即约氏黄杆菌CGMCC No.14444，该菌株营养要求简单，发酵时间短，应用于褐藻胶裂解酶生产中可显著缩短生产周期，降低生产成本。本发明专利技术还公开了利用此菌种制备褐藻胶裂解酶及对含有褐藻酸盐的高粘原料的降粘处理。本发明专利技术提供的约氏黄杆菌WX‑11所产的褐藻胶裂解酶可降解海藻酸钠，生成具有生物活性的褐藻寡糖，可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及海藻加工等领域。

A strain producing yellow alginate lyase

The invention discloses a Flavobacterium Flavobacterium which produces alginate lyase and belongs to the biotechnology field. Flavobacterium johnsoniae WX 11, Flavobacterium yoelii CGMCC No. 14444, is separated from soil and river water samples. The strain has simple nutritional requirements and short fermentation time. The application in alginate lyase production can significantly shorten the production cycle and reduce production costs. The invention also discloses the preparation of alginate lyase by using the strain and the viscosity reduction treatment of high-viscosity raw materials containing alginate. The alginate lyase produced by Flavobacterium yoelii WX 11 can degrade sodium alginate and produce alginate oligosaccharides with biological activity, which can be widely used in agriculture, food, feed addition, medicine and algae processing and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌
本专利技术涉及一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌，属于生物

技术介绍
我国海洋资源丰富，是世界上海洋藻类养殖及加工利用规模最大的国家，海藻产量约占世界总产量的60％，超过了1300万吨。而这丰富的藻类中含有大量的褐藻胶等多糖及糖醇类物质，使得海藻加工及其高值化利用成为我国海洋资源综合利用的重要领域。研究发现，褐藻胶降解产物褐藻寡糖具有多种生物活性，包括促生长作用、增强免疫力抗肿瘤活性、神经保护作用等，因此，褐藻胶降解产物中的功能性寡糖的开发在国际上已成为一个研究热点。在用于制备褐藻寡糖的方法中，酶解法相较于化学法和物理法具有反应条件温和，产物均一，特异性强，对环境无污染等优点。目前，褐藻胶裂解酶已成为酶法制备褐藻低聚糖的主要工具酶。这类工具酶除了可以制备褐藻寡糖，还在诸多方面都具有重要的研究价值和应用价值，如原生质体的制备，肺囊性纤维化的辅助治疗等。所以，对于褐藻胶裂解酶的挖掘有广阔的前景。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶，通过β消去反应能够降解大分子褐藻胶生成低分子量的褐藻寡糖或单糖。褐藻胶裂解酶按照底物专一性可分为三类：①特异性降解古洛糖醛酸片段(PolyG)的1，4-α-古洛糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)；②特异性降解甘露糖醛酸片段(PolyM)的1，4-β-甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)；③可以同时降解古洛糖醛酸片段和甘露糖醛酸片段的裂解酶。目前已报道的褐藻胶裂解酶主要是PM内切酶，少部分是PG内切酶和双功能酶，PM外切酶和PG外切酶报道很少。目前已发现上百种微生物可产生褐藻胶裂解酶，这些微生物大部分来源于细菌，如固氮菌、棒杆菌、交替假单胞菌及黄杆菌等。已有几十种褐藻胶裂解酶的基因已通过基因工程的手段被外源表达。然而，现有的褐藻胶裂解酶普遍存在酶活力较低、酶稳定性较差、酶与产物结合紧密、分离困难等问题，这些缺点限制了褐藻胶裂解酶的推广应用。Sigma公司提供了一种褐藻胶裂解酶制剂产品A1603，但价格昂贵，这极大地限制了褐藻胶裂解酶及酶系在食品、医药、工农业等领域的广泛应用。所以，探索新型的酶制备生产技术，提高酶的产量，创新酶的应用模式已成为必要。
技术实现思路
本专利技术首先提供一种产褐藻胶裂解酶的来源，即：约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，约氏黄杆菌的保藏编号为CGMCCNo.14444。本专利技术提供的约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11在以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基上形成的菌落呈黄色，菌苔湿润，菌落圆型，光滑，透明或半透明，稍凸起；革兰染色呈阴性，菌体呈杆状或球杆状，无芽孢。本专利技术还提供一种用于诱导上述约氏黄杆菌WX-11发酵产褐藻胶裂解酶的培养基，以海藻酸和/或海藻酸盐为碳源；所述海藻酸盐可以是海藻酸钠。本专利技术还提供一种应用所述约氏黄杆菌WX-11产褐藻胶裂解酶的方法，所述方法包括如下步骤：(1)活化约氏黄杆菌WX-11；具体地，可以取约氏黄杆菌WX-11接种于固体培养基中，在25～30℃的条件下，培养24h，制得活化菌株；所述固体培养基是在种子培养基中添加15～20g/L琼脂粉。(2)制备种子液；具体地，取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在25～30℃，150～220r/min的条件下，培养8～12h，即得种子液；所述种子培养基可以是：海藻酸钠1-5g/L、蛋白胨1-5g/L、酵母粉1-5g/L、NaCl0-10g/L、pH自然。(3)发酵生产褐藻胶裂解酶；具体地，取步骤(2)的种子液，按体积比1～5％的比例接种于发酵培养基中，在25～30℃，150～220r/min条件下培养18～20h，即得菌体发酵液，将所得发酵液进行离心，然后收集上清液，即得到粗酶液；所述发酵培养基配方可以是：海藻酸钠1-5g/L、蛋白胨1-5g/L、酵母粉1-5g/L、NaCl0-10g/L、pH自然。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一株新型的产褐藻胶裂解酶的菌株约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11，它是一株极具潜力的褐藻胶裂解酶生产菌株，其优点主要体现在：与其他产褐藻胶裂解酶野生菌相比(如黄杆菌S20、假交替单胞菌属Pseudoalteromonassp.L1、BacillusweihaiensisAlg07等)，本专利技术中的约氏黄杆菌WX-11营养要求简单，发酵时间短，应用于褐藻胶裂解酶生产中可显著缩短生产周期，降低生产成本。生物材料保藏约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.14444。附图说明图1约氏黄杆菌WX-11的系统发育树。图2约氏黄杆菌褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠产物的薄层色谱图；图中，“C”代表聚合度1-6的褐藻寡糖混合标准样品，“1”代表约氏黄杆菌所产褐藻胶裂解酶对海藻酸钠酶解24h后的产物。具体实施方式本专利技术下述实施例中，褐藻胶裂解酶的1个酶活力单位(U)定义为：1mL的酶液每分钟产生1μg还原糖所需的酶量。酶活测定方法为DNS法。实施例1：约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11的分离鉴定以及菌株的保存(1)约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11的分离及筛选于超市购买干海带，剪成块状后包在纱布中，分别放于装有江南大学校区河水、土壤或自来水的锥形瓶中，孵育2周后，取样。将取得的样品于加入磁珠的生理盐水中震荡2h，过夜静置，接种到以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基中，30℃，220r/min培养至块状海带降解后转接，连续传代5次。将连续驯化5代的培养液用生理盐水分别稀释10-7、10-8、10-9倍，涂布于唯一碳源筛选平以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，30℃培养3-5d，待平板上长出单菌落，随机挑取菌落形态各异的单菌落于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上划线。接入装有以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的24孔板中，30℃，300r/min培养24-30h，待菌液浑浊对菌液进行保藏和复筛。将初筛得到的单菌落点种于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，培养3天后CaCl2显色法观察透明圈大小；将单菌落接种于以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基内，30℃培养2天，6000-8000r/min下离心10-30min，收集上清液，用DNS法测定酶活。所述以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的配方如下：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，K2HPO42g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，pH自然。所述以海藻酸钠为唯一碳源固体培养基的配方，是在以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基配方基础上增加琼脂。(2)约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11的鉴定对筛得的菌株(编号为HGJ002)进行生理生化鉴定：该菌株呈杆状或球杆状，无鞭毛，无芽胞，革兰染色呈阴性；在以海藻酸钠为唯一碳源的筛选平板上培养48h的菌落呈黄色，菌落较小，为圆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)，已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14444。

【技术特征摘要】
1.约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.14444。2.应用权利要求1所述约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，步骤如下：(1)活化约氏黄杆菌WX-11；(2)制备约氏黄杆菌WX-11的种子液；(3)发酵生产褐藻胶裂解酶。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，取约氏黄杆菌WX-11接种于固体培养基中，在25～30℃的条件下，培养得到活化后菌株。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)，取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在25～30℃，150～220r/min的条件下，培养8～12h，即得种子液。5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)，取步骤(2)的种子液，按体积比1～5％的比例接种于发酵培养基中，在25～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李恒，史劲松，郝瑶，许正宏，龚劲松，李会，季珂，杨敏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32