一种弧菌H11及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种弧菌H11及其应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018172。本发明专利技术筛选到一株高效水解浒苔多糖的菌株，且它水解获得的还原糖能够被能源菌株利用生成生物能源物质，与现有的水解浒苔多糖的单一菌株相比较，本发明专利技术中的弧菌H11的水解能力最强。本发明专利技术通过弧菌的水解与梭菌的厌氧发酵相结合，从而实现浒苔的高值化利用。

Vibrio H11 and its application

The invention relates to a Vibrio H11 and its application, which is stored in a typical culture preservation center in China, and its preservation number is CCTCC NO: M 2018172. The present invention screens a strain with high hydrolysis efficiency of Polysaccharide from Enteromorpha prolifera, and the reduced sugar obtained by hydrolysis can be used by energy strains to produce bioenergy substances. Compared with the existing single strain of polysaccharide hydrolysis from Enteromorpha prolifera, the Vibrio H11 in the present invention has the strongest hydrolysis ability. The invention realizes high value utilization of Enteromorpha prolifera by combining hydrolysis of Vibrio and anaerobic fermentation of Clostridium.

【技术实现步骤摘要】
一种弧菌H11及其应用
本专利技术微生物生物技术和资源生物
，尤其涉及一种弧菌H11及其应用。
技术介绍
浒苔(Enteromorpha)是一种大型绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)石莼目(Ulvales)石莼科(Ulvaceae)的植物。近年来由于全球变暖、海水富营养化，导致浒苔迅速生长，对海洋生态环境带来了极大的影响。早期对浒苔的填埋和焚烧，对周围的水体和土壤造成了严重污染，且造成了生物质资源的浪费。如何有效利用浒苔这一爆发性资源，已成为改善海洋生态环境和海藻综合利用的研究热点。浒苔作为一种大型绿藻是一种潜在的可再生的生物燃料源，可用于制取生物油、沼气或乙醇等。然而由于浒苔多糖成份复杂且尚不清楚，导致研究者们对于浒苔的高值化利用的研究还比较少，对浒苔及浒苔多糖在活性寡糖或生物能源方面在应用还是很少。目前，对浒苔的处理方法主要有水热法、快速热解法和发酵法。但水热法和快速热解法获得的燃油很难被直接被利用；所以，微生物酶法受到广大研究者的青睐。在当前用于微生物产醇类、酸类的主要碳源为葡萄糖、木糖、果糖等单糖类，其成本太高。但浒苔这一爆发性资源可被水解成可发酵还原糖，作为一种新型的产生物能源在原料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种弧菌H11及其应用，以解决目前浒苔多糖成份复杂且尚不清楚，导致研究者们对于浒苔的高值化利用的研究还比较少，所以研究浒苔利用的方案比较单一，目前主要是物理化学的方法，其方法具有很大的局限性等问题。为解决上述问题，本专利技术提供了一种弧菌H11(Vibriosp.H11)，于2018年3月31日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为：CCTCCNO：M2018172，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心。该专利技术菌株能以浒苔多糖为唯一碳源的培养基中生长，且其为革兰氏染色阴性菌；生理生化特征具有VP阳性，MR阳性，明胶液化阴性。能以“绿潮”浒苔生物质作为唯一碳源和能源生长并水解成梭菌可发酵的还原糖，用于厌氧发酵生成生物氢气和生物有机溶剂等。上述弧菌H11的培养方法为：将所述弧菌H11菌接种到浒苔多糖为唯一碳源生长，培养基组成为(1L)(NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8g；KH2PO4，0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.1g；FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1mg；ddH2O1L；浒苔多糖，20g；胰蛋白胨，5g/L中，在温度为30℃，pH为8.71培养12h。培养基先在121℃灭菌20min。弧菌H11的应用，可用于水解“绿潮”生物质。主要用于将浒苔水解为成梭菌可发酵的还原糖。弧菌H11将浒苔中的浒苔多糖水解为还原糖后梭菌的厌氧发酵转化为生物能源物质。应用方法主要包括：在含有浒苔粉末或浒苔多糖的厌氧发酵培养基中加入含有所述弧菌H11的浓缩的粗酶液，并40℃、200rpm摇床中水解48h。再接种梭菌厌氧发酵。梭菌可以为ClostridiumacetobutylicumWA菌株。浒苔多糖是一种结构复杂的杂多糖，只知道其主要组成成份，其结构目前还没有清楚的报道。对于浒苔多糖的水解，混合菌群水解能力较好，但菌群组成容易变化，且不容易保存。本专利技术中的Vibriosp.H11菌株作为单一菌株，其水解浒苔多糖的能力是最强的。对于“绿潮”浒苔这一生物质的综合治理和高值化利用，目前的物理化学方法对成本要求高，且产生的废弃液容易污染环境。本专利技术中将浒苔最终通过微生物的方法转化为生物能源物质，成本低且环境无污染。目前，这是首次利用微生物发酵的方法将浒苔转化为生物能源物质。与现有技术相比，本专利技术筛选到一株高效水解浒苔多糖的菌株，且它水解获得的还原糖能够被能源菌株利用生成生物能源物质，与现有的水解浒苔多糖的单一菌株相比较，本专利技术中的弧菌H11的水解能力最强。本专利技术通过弧菌的水解与梭菌的厌氧发酵相结合，从而实现浒苔的高值化利用。附图说明图1是Vibriosp.H11的系统发育树；图2是Vibriosp.H11的电镜图；图3是Vibriosp.H11的卢戈氏碘液染色图；图4是Vibriosp.H11的生长曲线及发酵上清中还原糖含量曲线；图5是Vibriosp.H11粗酶液酶活力曲线图；图6是C.acetobutylicumWA菌株利用不同的可发酵还原糖厌氧发酵产生的生物氢气量；图7是C.acetobutylicumWA菌株利用不同含量的浒苔多糖的可发酵还原糖产生的生物溶剂量；图8是C.acetobutylicumWA菌株利用不同含量的浒苔粉末的可发酵还原糖产生的生物溶剂量。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。实施例1(1)Vibriosp.H11的筛选培养前期在海南近海海域获得绿藻样品，将样品经无菌生理盐水漂洗后，用无菌研钵研磨成匀浆，静置后用移液枪轻轻吸取上清液1mL加入浒苔多糖无机盐培养基中，25℃，150rpm培养一天后；再转接1mL的发酵液至新的浒苔多糖无机盐培养基继续培养，重复操作3次。将获得的发酵液按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7进行梯度稀释，然后涂布于浒苔多糖平板上25℃倒置培养一天。观察形态，挑取单菌落并多次划线获得纯培养。然后通过浒苔多糖无机盐培养基发酵液中还原糖含量(DNS法)来初步确定该菌是否具有浒苔多糖水解能力。最终获得一株弧菌H11，其酶活力最高。其中的浒苔多糖无机盐培养基的主要组成为:1L(NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8g；KH2PO4，0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.1g；FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1L浒苔多糖浸提液。(2)Vibriosp.H11的鉴定Vibriosp.H11为革兰氏染色阴性菌株；生理生化特性具有VP阳性，MR阳性，明胶液化阴性；可利用下列物质作为碳源：D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、蔗糖、甘露醇、柠檬酸、淀粉；结果如表1所示。表1Vibriosp.H11的生理生化特性采用菌落PCR方法，直接取单菌落作为模板进行PCR。利用PCR扩增16SrDNA的引物为一对通用引物，27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’。PCR反应条件为：94℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。将PCR扩增产物纯化后，送测序结果与Genbank上的序列进行Blast分析，序列长度为1385bp，本专利技术与溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)具有很大的同源性；其16SrDNA序列如SEQID:NO.1所示。将该序列与Genbank中序列进行比对，选取相似的菌株，用MEGA7软件构建系统进化树，所构建的树状图如图1所示。同时，通过弧菌H11的电镜图发现，其为形态为杆状，且带有鞭毛如图2所示。弧菌H11在含2％浒苔多糖的无机盐培养基平板上培养12小时后，使用卢戈氏碘液染色具有明显的透明圈，如图3所示。弧菌H11以浒苔多糖作为唯一碳源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弧菌H11，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018172。

【技术特征摘要】
1.一种弧菌H11，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2018172。2.根据权利要求1所述弧菌H11的培养方法，其特征在于，所述培养方法为将所述弧菌H11菌接种到浒苔多糖为唯一碳源生长，培养基组成为(1L)(NH4)2SO4，1.0g；Na2HPO4，0.8g；KH2PO4，0.2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.1g；FeCl3·6H2O，5mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1mg；ddH2O1L；浒苔多糖，20g；胰蛋白胨，5g...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡忠，李进，徐艳，钟名其，林贤彬，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44