本发明专利技术公开了一种2,4,4′‑三溴联苯醚免疫原的制备方法及其用途，以2,4‑二溴苯酚与对氟硝基苯为原料进行亲电取代反应，合成4‑硝基‑2′,4′‑二溴联苯醚，然后通过加氢还原反应制备含氨基活性基团的2,4,4′‑三溴联苯醚半抗原，再用重氮化法将2,4,4′‑三溴联苯醚半抗原与牛血清蛋白偶联，制备2,4,4′‑三溴联苯醚免疫原；本发明专利技术中2,4,4′‑三溴联苯醚免疫原制备方法快速，简单，可用于制备2,4,4′‑三溴联苯醚人工多克隆抗体，对2,4,4′‑三溴联苯醚相关免疫分析方法的建立具有重要作用。
Preparation method and application of 2,4,4 '- three brominated diphenyl ethers immunogen
The present invention discloses a preparation method and application of 2,4,4'tribromodiphenyl ether immunogen. By electrophilic substitution reaction of 2,4' dibromophenol with p-Fluoronitrobenzene as raw material, 4'nitro 2', 4' Dibromobiphenyl ether is synthesized, and then 2,4'tribromodiphenyl ether containing amino active group is prepared by hydrogenation reduction reaction. 2,4,4'tribromodiphenyl ether hapten was coupled with bovine serum albumin by diazotization to prepare 2,4,4' tribromodiphenyl ether immunogen. The preparation method of 2,4,4'tribromodiphenyl ether immunogen in the present invention is rapid and simple, and can be used to prepare 2,4,4' tribromodiphenyl ether artificial polyclonal antibody, to 2,4,4'tribromodiphenyl ether. The establishment of brominated diphenyl ethers associated immunoassay is of great importance.
【技术实现步骤摘要】
一种2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法及其用途
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法及其用途。
技术介绍
2,4,4'-三溴联苯醚(BDE-28)是环境介质中分布最广、对生物体毒性最强的PBDEs同系物之一，与BDE-47、BDE-209等市面上几种商用多溴联苯醚不同，BDE-28作为低溴取代联苯醚，没有商业化产品，BDE-28具有疏水性、持久性和生物富集性，已有研究证明BDE-28容易对动物肝脏、肾脏、甲状腺的内分泌以及神经系统的发育造成危害，会诱导有机体产生突变，即使微量BDE-28进入环境介质也会通过呼吸作用或皮肤接触进入生物体内，并通过生物放大作用使生物体受到毒害；在复杂的环境介质中高溴取代联苯醚在高温、强紫外光照或微生物降解的条件下可生成低溴代联苯醚产物，高溴取代联苯醚的分解转化成为环境介质中BDE-28的关键来源。目前，常用的检测PBDEs方法有高分辨气相色谱质谱法、高效液相色谱法等，环境中BDE-28的含量极低且同系物较多，需要高灵敏度的分析检测设备、特异性的分离方法以及良好的净化技术以满足分析需求。气相色谱法是目前最常用的PBDEs分析检测方法，也是大多数国家检测PBDEs所采用的标准检测方法，具有较高的可靠性，但其耗时长且成本高，耗时长来自于样品复杂的前处理过程，高成本是因为仪器昂贵。免疫分析方法是一种基于抗原抗体间的特异性结合来检测各种物质的技术，具有特异性强、灵敏度高、分析容量大，成本低，操作简便，能够实现快速检测等优点，被广泛应用在生物、医学、环境、食品等领域。酶联免疫分析方法(ELISA)由于其灵敏度高、特异性强、在现场筛选和大量样本的快速检测已成为环境介质中残留污染物检测方法研究、相关产品开发使用的热点，如Feng等以BDE-121为研究对象，设计合成了BDE-121免疫原及多克隆抗体，建立了检测BDE-121的间接竞争ELISA免疫分析方法，检测限为0.644ng/mL。目前，国内外有关于多溴联苯醚污染物免疫分析方法的报道较少，而且多数研究集中在检出率较高的四溴联苯醚BDE-47，而关于三溴联苯醚BDE-28免疫分析方法的研究非常少，BDE-28免疫原是建立免疫分析方法测定BDE-28的基础，BDE-28免疫原的制备具有重要的应用价值和理论价值。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在前期研究的基础上发现，先以2,4-二溴苯酚与对氟硝基苯为原料，进行亲电取代反应，再通过加氢还原反应，得含氨基活性基团的BDE-28半抗原(BDE-28-NH2)，然后用重氮化法将BDE-28半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联得BDE-28免疫原(BSA-BDE-28)；本专利技术的目的在于提供一种2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法，用于制备BDE-28人工多克隆抗体和建立痕量2,4,4′-三溴联苯醚的免疫分析检测方法。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：一种2,4,4′-三溴联苯醚免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，本专利技术的第二方面，上述2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法，合成路线如式(Ⅱ)所示，具体地，包括以下步骤：(1)用2,4-二溴苯酚和对氟硝基苯进行亲电取代反应，得4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚；(2)以甲酸为还原剂、铂金碳为催化剂，通过加氢还原反应，将步骤(1)中4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚苯环上的硝基还原为氨基，得BDE-28半抗原；(3)以BSA为载体蛋白，经重氮化法将步骤(2)中BDE-28半抗原与BSA偶联，得BDE-28免疫原。优选地，上述2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法，具体过程为：(1-1)将1.04g2,4-二溴苯酚溶于8mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴中降温至0℃，分批次加入0.199g氢化钠，冰浴中搅拌20min后室温下放置10min，缓慢加入0.583g对氟硝基苯，90℃下搅拌反应2h；再向上述反应混合液中加入10mL超纯水，轻微震荡数次后用25mLCH2Cl2萃取三次，再合并有机萃取液，经无水MgSO4干燥、旋蒸浓缩和硅胶层析柱分离净化，得橘黄色油状产物；(2-1)取0.485g步骤(1-1)中橘黄色油状产物溶解于8mL正丁胺，依次加入0.770g碳负载量为5％的铂金碳催化剂、0.4mL甲酸，90℃下搅拌反应2h；待反应液冷却后加入2mLCH2Cl2，反应混合物经过滤、无水MgSO4干燥和硅胶层析柱分离净化，得黄色固体产物；(3-1)取0.0343g步骤(2-1)中黄色固体产物，在搅拌下加入1.5mL超纯水，缓缓加入0.05mL浓盐酸，加热搅拌反应20min后置于冰浴中冷却，再向反应液中加入亚硝酸钠溶液，同时用淀粉碘化钾试纸显色，试纸由白色变为灰蓝色时停止滴加，4℃下搅拌反应1h；然后加入2.0g尿素，4℃、5000rpm离心15min，取上清液逐滴加入到10mL、0.08mMBSA溶液直到混合物变成橙色，4℃继续反应2h，反应溶液装入透析袋中，4℃下用0.01M、pH7.40PBS缓冲液透析3d，-20℃下保存，即得。优选地，步骤(1-1)中所述硅胶层析柱中的淋洗液为正己烷：乙醚＝2:3(v/v)。优选地，步骤(1-1)中所述橘黄色油状产物为4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚，分子式为C12H6O3NBr3，产率为66.1％。优选地，步骤(2-1)中所述硅胶层析柱的淋洗液为正己烷:乙酸乙酯＝2:3(v/v)。优选地，步骤(2-1)中所述黄色固体产物为4-氨基-2′,4′-二溴联苯醚，分子式为C12H8ONBr3，产率为61.7％。本专利技术的第三方面，上述2,4,4′-三溴联苯醚免疫原在制备2,4,4′-三溴联苯醚人工多克隆抗体的应用，及作为痕量2,4,4′-三溴联苯醚免疫分析检测的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术先用2,4-二溴苯酚中苯环上的羟基与4-氟硝基苯中苯环上的氟原子进行亲电取代反应，再通过加氢还原反应得含氨基活性基团的BDE-28半抗原，然后用重氮化法将BDE-28半抗原与牛血清蛋白偶联得BDE-28免疫原，合成方法简单、快速，产率高，用于制备BDE-28人工多克隆抗体，及建立免疫分析方法检测环境介质中痕量2,4,4′-三溴联苯醚。附图说明图1为BDE-28半抗原的红外光谱图；图2为BDE-28半抗原的核磁共振氢谱图；图3为BDE-28半抗原、载体蛋白(BSA)和偶联物的紫外光谱图；图4为考马斯亮蓝法测定BSA浓度的标准曲线；图5为抗BDE-28抗体效价的变化。具体实施方式下面结合附图详细说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例，以下实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。实施例1BDE-28免疫原的制备第一步、取1.04g2,4-二溴苯酚(4.13mmol)溶于8mL干燥的DMF中，冰浴中降温至0℃；分批次加入0.199g氢化钠(8.28mmol)，冰浴中搅拌20min后，反应混合液室温下放置10min；然后缓慢加入0.583g对氟硝基苯(4.13mmol)，90℃加热搅拌反应2h；向反应混合液中加入10mL超纯水(ddH2O)，轻微震荡数次后，用CH2Cl2萃取(25mL×3)，合并有机萃取液，用无水MgS本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种2,4,4′‑三溴联苯醚免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，
【技术特征摘要】
1.一种2,4,4′-三溴联苯醚免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，2.如权利要求1所述2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法，其特征在于，合成路线如式(Ⅱ)所示，包括以下步骤：(1)用2,4-二溴苯酚和对氟硝基苯进行亲电取代反应，得4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚；(2)以甲酸为还原剂、铂金碳为催化剂，通过加氢还原反应将步骤(1)中4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚苯环上的硝基还原为氨基，得2,4,4′-三溴联苯醚半抗原；(3)以BSA为载体蛋白，经重氮化法将步骤(2)中2,4,4′-三溴联苯醚半抗原与BSA偶联，得2,4,4′-三溴联苯醚免疫原。3.如权利要求2所述2,4,4′-三溴联苯醚免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法过程为：(1-1)将1.04g2,4-二溴苯酚溶于8mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴中降温至0℃，分次加入0.199g氢化钠，冰浴中搅拌20min后室温下放置10min，缓慢加入0.583g对氟硝基苯，90℃下搅拌反应2h；再向上述反应混合液中加入10mL超纯水，轻微震荡数次后用25mLCH2Cl2萃取三次，再合并有机萃取液，经无水MgSO4干燥、旋蒸浓缩和硅胶层析柱分离净化，得橘黄色油状产物4-硝基-2′,4′-二溴联苯醚；(2-1)取0.485g步骤(1-1)中橘黄色油状产物溶解于8mL正丁胺，依次加入0.770g铂金碳催化剂、0.4mL甲酸，90℃下搅拌反应2h；待反应液冷却后加入2mLCH2Cl2，反应混合物经过滤、无水MgSO4干燥和硅胶层析柱分离净化，得黄色固体产物4-氨基-2′,4′-二溴联苯醚；(3-1)取0.0343g步骤(2-1)中黄色固体产物，在搅拌下加入1.5mL超纯水，缓缓加...
【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，马振，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。