一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，属于免疫分析技术领域。其采用气单胞菌属外膜蛋白（Outer membrane protein,Omp）OmpF上的保守型多肽PepF1与牛血清白蛋白（BSA）进行化学共价偶联，合成了气单胞菌保守性多肽表位抗原。在特定多肽序列PepF1和偶联反应条件下该免疫原免疫的小鼠血清或蛋鸡卵黄抗体对3株嗜水气单胞菌和4株气单胞菌属细菌均有效价，同时对于普通E.coli、E.coli O157：H7、鳗弧菌、副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、交替假单胞菌、迟缓爱德华菌没有交叉反应。而菌体免疫的小鼠血清或卵黄抗体对普通E.coli CICC21530和DH5α有交叉反应。该新型免疫原可以用来制备水产病原菌气单胞菌交叉型单克隆抗体或者卵黄球蛋白。

An immunogen synthesis method for preparing cross type antibodies of Aeromonas species of Aquatic Pathogenic Bacteria

The invention relates to an immunogenic synthesis method for preparing cross-type antibodies against Aeromonas, an aquatic pathogen, belonging to the field of immunoassay technology. The conserved polypeptide epitope antigen of Aeromonas was synthesized by covalent coupling of the conserved polypeptide PepF1 from the outer membrane protein (Omp) OmpF with bovine serum albumin (BSA). Under specific peptide sequence PepF1 and coupling reaction conditions, the immunized mice serum or egg yolk antibody had titers against three strains of Aeromonas hydrophila and four strains of Aeromonas, and it also had titers against common E.coli, E.coli O157:H7, Vibrio anguillarum, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus. There was no cross reaction between alternatively Pseudomonas and Edward. However, the serum or yolk antibodies of the mice immunized with the bacteria had a cross reaction to the common E.coli CICC21530 and DH5 alpha. The new immunogen can be used to prepare cross-type monoclonal antibodies or yolk globulin against Aeromonas aquatic pathogens.

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法
本专利技术涉及一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，属于免疫分析

技术介绍
嗜水气单胞菌是鱼类养殖败血症的主要致病菌之一，给淡水鱼、水产养殖业带来巨大经济损失。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，如：溶血素、组织毒素、坏死毒素、肠毒素和蛋白酶等使水产动物致病。实际生产中由嗜水气单胞菌感染的暴发性出血病较多，因嗜水气单胞菌的血清型很多，况且感染的对象不同，所以症状也各异。如白鲢暴发性出血病、甲鱼败血病、黄鳝出血病、鳗鲡红鳍病等。该菌为条件致病菌，当环境骤变，水质恶化时，常会与其它菌（如温和产气单胞菌、弧菌等）混合感染使病情加重。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，多为恶性传染病，死亡率很高。目前，控制嗜水气单胞菌病的主要手段包括抗生素和疫苗。目前我国禽类、水产养殖业病害的流行以及抗生素滥用比较普遍，导致肉类、鱼类、环境中的抗生素残留问题突出，对我国食品安全、出口贸易、环境保护、公共卫生带来巨大的威胁。据报道，2013年中国抗生素的使用量总量16.2万吨，其中48%为人用抗生素，其余为兽用抗生素。人用抗生素绝大部分用于疾病的治疗并呈下降趋势，而兽用抗生素更大部分是用到饲料当中。由于兽用抗生素价格低廉，为了防病许多养殖户不加节制的使用。而牛、羊、鸡、鸭、鱼等吃了兽用抗生素后又通过排泄进入水、土壤、农作物当中，最后又反作用于人类，导致耐药性细菌和“超级细菌”问题，形成了一个恶性的生态链循环系统。同时，由于该病原菌血清型多样，普通菌体疫苗的效力差异很大，往往对免疫菌株的效果较好，而对其它血清型没有效果或效果一般。基于保守性外膜蛋白的重组蛋白疫苗效果较好，但面临着接种途径多为逐条鱼注射免疫，费时费力、成本高、易造成鱼类死亡等问题；不仅如此，兽用疫苗的审批过程非常复杂，往往需要5-10年的时间，而且要配套医药级GMP(GoodManufacturingPractice)生产车间，不能满足市场需求。卵黄球蛋白（IgY）作为食品成分和免疫识别活性物质在水产疾病控制方面具有绿色、广谱、可持续的特点。禽源抗体是指用特定的抗原免疫产蛋禽类后，从免疫禽蛋的卵黄中用物理方式获得的具有抗原特异性、耙向性的免疫球蛋白质，同时作为食品原料其食用的安全性较好；美国FDA已将禽源抗体视为替代抗生素的首选“药物”，并认为禽源抗体作为食品比作为药物更有利，并将其列入“一般公认安全物质(GenerallyAcceptedasSafe，GRAS)”范畴。相比于传统控制手段采用抗生素、疫苗防治相关疾病，禽源抗体防治疾病具有以下特点：（1）高效、针对性强，利用抗原抗体特异性免疫反应，只抑制相应的病原。（2）绿色安全，卵黄抗体为鸡蛋卵黄组成成分，对动物、人体无副作用，环境中可降解，无残留问题。（3）相比疫苗，研发、应用程序简化，在特定病原的防治中使用方法简单，多通过口服、喷涂等方式进行，使用成本低。（4）应用范围广，卵黄抗体为大批量开发功能性食品和疾病诊断、抗细菌感染、抗病毒感染的预防治疗提供了新的选择。（5）容易获取并且持续性好，在获取致病株或者保守性抗原后即可免疫活鸡，产蛋周期长、产量高。高免的鸡卵黄球蛋白（IgY）对水产病原菌均匀识别性和特异性为其作为饲料添加物用于水产病害的生物识别、抑制增殖、绿色防控奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，为制备水产病害菌嗜水气单胞菌属内广谱性单克隆抗体、卵黄抗体提供了方法和思路。本专利技术的技术方案，为实现上述目的，本专利技术选用N端修饰Cys的气单胞菌属外膜蛋白OmpF的保守性多肽表位PepF1作为抗原，并用SMCC法合成了气单胞菌多肽抗原与载体蛋白BSA的人工抗原。气单胞菌表面抗原种类繁多、具体结构也因菌株血清型不同而多变，保守性和表面可暴露的多肽抗原表位是制备气单胞菌属特异性抗体的基础。然而，多肽抗原分子量通常在1000-2000之间，属于分子半抗原，无法直接免疫。通过双功能偶联剂SMCC与载体蛋白BSA偶联后就具有了免疫原性，可以制备抗体。将气单胞菌保守性多肽表位PepF1-SMCC-BSA免疫原免疫BALB/c小白鼠和产蛋鸡（罗氏鸡）后即可得到气单胞菌属交叉型鼠抗体或卵黄抗体。一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，步骤为：（1）多肽PepF1的修饰：将筛选得到的气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF1在N端修饰半胱氨酸Cys；（2）BSA的衍生：将双功能偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC与牛血清白蛋白BSA按照反应摩尔比40-80:1在0.05-0.15M/L磷酸盐缓冲液中室温反应1-2h，得SMCC-BSA，超滤去除多余Sulfo-SMCC；（3）免疫原的制备：将步骤（1）所得多肽PepF1与步骤（2）所得衍生后的BSA按照反应摩尔比30-60:1在0.05-0.15M/L磷酸盐缓冲液中室温反应2-6h，透析后即制得气单胞菌属交叉型抗体的免疫原PepF1-SMCC-BSA。所述气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF1具体为TyrLysGlyGluGlyArgGlyTyrGluLeuAlaAla。该免疫原合成方法具体步骤如下：取载体蛋白BSA10mg用0.1M的PB缓冲液溶解，将用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解的双功能偶联剂Sulfo-SMCC按照反应摩尔比Sulfo-SMCC:BSA为40-80:1加入到BSA溶液中，磁力搅拌下室温反应1-2h；反应结束后采用Millipore超滤管超滤2-4次，得SMCC-BSA，除去未反应的双功能偶联剂；将0.05-0.15M/L的PB缓冲液溶解的经N端修饰半胱氨酸Cys的气单胞菌保守性多肽表位PepF1按照反应摩尔比多肽PepF1:BSA为30-60:1加入到反应溶液中，磁力搅拌下室温反应2-6h；随后用0.01-0.05M/L的PBS透析反应溶液，4-6h更换透析液一次，透析2-3天，即得到气单胞菌属交叉型抗体的免疫原PepF1-SMCC-BSA。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种制备水产病害菌气单胞菌属内广谱、属外特异性的鼠抗体或卵黄抗体的免疫原制备方法；本专利技术筛选了外膜蛋白OMPF上的气单胞菌属的保守性氨基酸序列PepF1。并首次合成了多肽PepF1-SMCC-BSA人工免疫原，将人工多肽抗原PepF1-SMCC-BSA免疫蛋鸡和BALB/c小白鼠，间接ELISA试验表明免疫的鸡卵黄抗体IgY以及小鼠血清对测试的3株嗜水气单胞菌（CICC10500，MCCC1A00190,MCCC1A0007）、4株气单胞菌属细菌（波氏气单胞菌、斑点气单胞菌、肇东气单胞菌、双壳气单胞菌）均有效价，同时对于普通E.coli、E.coliO157：H7、鳗弧菌、副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、交替假单胞菌、迟缓爱德华菌没有交叉反应，特异性良好。而直接免疫嗜水气单胞菌菌体的小鼠血清和卵黄抗体对普通E.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，其特征在于步骤为：（1）多肽PepF1的修饰：将筛选得到的气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF1在N端修饰半胱氨酸Cys；（2）BSA的衍生：将双功能偶联剂4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo‑SMCC与牛血清白蛋白BSA按照反应摩尔比40‑80:1在0.05‑0.15 M/L 磷酸盐缓冲液中室温反应1‑2h，得SMCC‑BSA，超滤去除多余Sulfo‑SMCC；（3）免疫原的制备：将步骤（1）所得多肽PepF1与步骤（2）所得衍生后的BSA按照反应摩尔比30‑60:1在0.05‑0.15 M/L磷酸盐缓冲液中室温反应2‑6h，透析后即制得气单胞菌属交叉型抗体的免疫原PepF1‑SMCC‑BSA。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，其特征在于步骤为：（1）多肽PepF1的修饰：将筛选得到的气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF1在N端修饰半胱氨酸Cys；（2）BSA的衍生：将双功能偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC与牛血清白蛋白BSA按照反应摩尔比40-80:1在0.05-0.15M/L磷酸盐缓冲液中室温反应1-2h，得SMCC-BSA，超滤去除多余Sulfo-SMCC；（3）免疫原的制备：将步骤（1）所得多肽PepF1与步骤（2）所得衍生后的BSA按照反应摩尔比30-60:1在0.05-0.15M/L磷酸盐缓冲液中室温反应2-6h，透析后即制得气单胞菌属交叉型抗体的免疫原PepF1-SMCC-BSA。2.根据权利要求1所述用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法，其特征在于：所述气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF1具体为T...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文彬，盘赛昆，刘丹丹，桑雨浓，高云山，赵永慧，秦琦，秦悦，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32