一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途，包括：先用苯并芘标准品进行亲电取代反应生成6‑碘苯并芘，再通过Heck偶联反应得苯并芘的羰基衍生物BaP＝O即BaP半抗原，然后经肟化反应将BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联，得BaP免疫原BSA‑BaP；上述合成方法简单、快速，提供了一种制备特异性强的BaP免疫原的新途径，可用于制备BaP人工多克隆抗体及建立苯并芘免疫分析检测方法。

Preparation method and application of benzopyrene immunogen

The present invention discloses a preparation method of benzopyrene immunogen and its application, which includes: firstly, 6_iodobenzopyrene is produced by electrophilic substitution reaction with benzopyrene standard, then the carbonyl derivative BaP=O, namely BaP hapten, is obtained by Heck coupling reaction, and then carbonylation of BaP hapten is carried out by oximation reaction. BaP immunogen BSA_BaP was prepared by coupling BSA with activated ester method. The method is simple and rapid, and provides a new way to prepare specific BaP immunogen. It can be used to prepare BaP artificial polyclonal antibody and establish benzopyrene immunoassay method.

【技术实现步骤摘要】
一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途。
技术介绍
苯并芘(BaP)又称3,4-苯并芘，工业生产和生活过程中煤炭、石油和天然气等燃料不完全燃烧以及食物在熏制、烘烤和煎炸等高温烹调过程中都会产生BaP，具有致癌性、致畸性和致突变性，在环境介质中广泛存在。苯并芘的毒性具有长期和隐匿特性，人体接触或摄入BaP后能够在体内蓄积，在表现出症状前具有较长潜伏期。由于BaP来源广泛，且对人体危害性较大，引起了国内外学者的广泛研究，目前国内外对苯并芘检测的研究多集中于大气、水体等环境介质及粮油、肉类等食品，最常用的检测方法有气相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱等仪器分析方法。目前，酶联免疫吸附法(ELISA)用于大批量样品的快速筛查与检测，受到广泛的研究，如Matschulat等制备了BaP单克隆抗体，利用ELISA方法检测了水中BaP的含量，灵敏度IC50为24ng/mL；Pschenitza等利用固相萃取结合ELISA的方法检测食用油中的苯并芘，其检测下限为0.63μg/mg。另外，生物素-亲和素-酶联免疫吸附法(BA-ELISA)等高灵敏度的免疫检测技术不断兴起，是一种将抗原抗体间的特异性识别免疫反应与酶的高效催化性能以及生物素-亲和素系统结合在一起而发展起来的非均相免疫分析技术，即将抗体或抗原生物素化，利用固相包覆的抗原或抗体专一、特异性的识别结合，再利用链酶亲和素偶联生物素化抗体，最后通过酶来催化小分子底物产生肉眼可辨别的颜色变化，由于固相载体上结合的酶量与待测物的量呈现一定的量比关系，可实现定性或定量分析。在BA-ELISA方法中，一个亲和素分子上的4个亚单位都能分别专一特异性的识别结合一个生物素分子，亲和常数高达1015mol/L，提高被固相结合的酶数量，减少与试剂间的非特异性识别反应，提高检测方法的灵敏度。上述免疫分析方法均是基于抗原抗体间的特异性识别免疫反应的检测技术，BaP免疫原的制备是建立检测BaP免疫分析技术的基础，BaP分子不含能够与蛋白质偶联的活性官能基质，需要在BaP小分子上引入活性官能团，以便与载体蛋白偶联如氨基、羧基、羰基等。目前关于BaP免疫原的制备方法报道较少，且存在操作复杂、产率较低或所需设备要求较高，有关BaP免疫原制备方法种类较少且单一。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在前期研究的基础上发现，先用苯并芘标准品进行亲电取代反应生成6-碘苯并芘，再通过Heck偶联反应得BaP半抗原即苯并芘的羰基衍生物BaP＝O，然后经肟化反应将BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联，得BaP免疫原BSA-BaP。本专利技术提供了一种制备特异性强的BaP免疫原的新途径，合成方法简单、快速，可用于制备BaP人工多克隆抗体及建立苯并芘的免疫分析检测方法。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：一种苯并芘免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，本专利技术的第二方面，上述苯并芘免疫原的制备方法，合成路线如式(Ⅱ)所示，具体地，包括以下步骤：(1)用苯并芘标准品进行碘代反应，在室温下反应48h得中间产物6-碘苯并芘，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；(2)在反应温度为120℃的条件下，步骤(1)中所得6-碘苯并芘进行Heck偶联反应15h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全，再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化，得BaP半抗原；(3)通过肟化反应将步骤(2)中所得BaP半抗原的羰基羧基化，得BaP羧基衍生物，并通过展开剂为氯仿:甲醇＝9:1(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；然后以BSA为载体蛋白，用活化酯法将上述BaP羧基衍生物与BSA偶联，即得。在本专利技术的优选实施方案中，上述苯并芘免疫原的具体制备过程为：(1-1)取500mL三口圆底烧瓶，分别加入0.4g苯并芘、0.42gNIS、10g酸性氧化铝和30mL甲苯，室温搅拌反应48h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；(2-1)步骤(1-1)的反应产物经过滤除去残余酸性氧化铝后合并有机相，再分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和NaCl溶液、超纯水各萃取三次，所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩，用二氯甲烷和石油醚重结晶提纯后，得黄色粉末状固体物6-碘苯并芘，产率为76.2％；(3-1)向100mL单口烧瓶中分别加入0.27mg步骤(2-1)中所得黄色粉末状固体物、0.01g醋酸钯和0.02gLiCl，加入20mLDMF溶解，再依次加入70μL4-戊烯-2-醇、200μL三乙胺，120℃搅拌反应15h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；(4-1)将步骤(3-1)中反应产物冷却至室温，加入120mL甲苯，分别用饱和NaCl溶液、超纯水各萃取三次，所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩得粗产品，再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化，得浅黄色粉末状产物苯并芘半抗原，分子式为C27H20O，产率为86.2％；(5-1)取0.12g上述浅黄色粉末状产物、0.24g羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶于15mL干燥吡啶中，避光条件下震荡反应，并通过展开剂为氯仿:甲醇＝9:1(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；待反应完全后，取0.54g硼氢化钠溶于4.5mLddH2O中，加入到上述反应溶液内，室温震荡反应5h，然后在氮吹下去除溶剂，将残渣分别用盐酸溶液(pH2.0)和蒸馏水洗涤两次，60℃烘箱中烘干，得黄色固体产物BaP羧基衍生物，结构式为BaP-COOH；(6-1)称取0.082g上述黄色固体产物溶于0.5mLDMF中，将0.023gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS，)、0.412g二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于0.5mLDMF后，加入到上述溶液中4℃搅拌反应8h；再在6000rpm、4℃下高速离心20min，取上清液加入5mLBSA溶液(16mg/mL，溶于0.01M、pH7.40磷酸盐缓冲液)，4℃下搅拌反应过夜；重复离心，并将上清液用0.01M、pH7.40磷酸盐缓冲液透析3d，-20℃下保存，即得。本专利技术的第三方面，上述苯并芘免疫原在制备BaP人工多克隆抗体中的应用，以及作为苯并芘免疫分析检测的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术苯并芘免疫原的制备方法中，依次通过亲电取代反应、Heck偶联反应和肟化反应将BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联，制得BaP免疫原BSA-BaP，合成方法简单、快速，是制备特异性强的BaP免疫原的新途径，可用于制备BaP人工多克隆抗体及建立苯并芘免疫分析检测方法。附图说明图1为本专利技术中BaP免疫原的红外光谱图；图2为本专利技术中BaP免疫原的核磁共振氢谱图；图3为本专利技术中BaP半抗原、载体蛋白和BaP免疫原的紫外光谱图；图4为本专利技术中考马斯亮蓝法测定BSA浓度标准曲线；图5为本专利技术中抗BaP抗体效价的变化。具体实施方式下面结合附图详细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苯并芘免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，

【技术特征摘要】
1.一种苯并芘免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，2.如权利要求1所述苯并芘免疫原的制备方法，其特征在于，合成路线如式(Ⅱ)所示，包括以下步骤：(1)用苯并芘标准品进行碘代反应，室温下反应48h，得中间产物6-碘苯并芘；(2)步骤(1)中所得6-碘苯并芘进行Heck偶联反应，在120℃的条件下反应15h，分离净化，得BaP半抗原；(3)通过肟化反应将步骤(2)中所得BaP半抗原的羰基羧基化，得BaP羧基衍生物，以BSA为载体蛋白，经活化酯法将上述BaP羧基衍生物与BSA偶联，即得。3.如权利要求2所述苯并芘免疫原的制备方法，其特征在于，所述苯并芘免疫原的具体制备过程为：(1-1)取500mL三口圆底烧瓶，分别加入0.4g苯并芘、0.42gNIS、10g酸性氧化铝和30mL甲苯，室温搅拌反应48h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；再将上述反应产物经过滤后合并有机相，分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和NaCl溶液和超纯水各萃取三次，将所述有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩和重结晶提纯，得黄色粉末状固体物；(2-1)向100mL单口烧瓶中分别加入0.27mg步骤(1-1)中黄色粉末状固体物、0.01g醋酸钯和0.02gLiCl，加入20mLDMF溶解，再依次加入70μL4-戊烯-2-醇和200μL三乙胺，120℃搅拌反应15h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；再将反应产物冷却至室温并加入120mL甲苯，分别用饱和NaCl溶液和超纯水各萃取三次，所述有机相经无水MgSO4干燥、过滤和减压浓缩得粗产品，再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，马振，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31