川陈皮素抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种川陈皮素抗原及其制备方法与应用，包括：将川陈皮素与同时含有氨基和羧基的化合物B进行反应得到化合物C；化合物C和N‑羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到化合物D；化合物D与载体蛋白经偶联反应得川陈皮素抗原；川陈皮素抗原在制备用于检测样品中川陈皮素的酶联免疫试剂盒、川陈皮素的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。本发明专利技术的优点在于：能够方便、快捷地获得川陈皮素抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。川陈皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。

Antigenin of citrus extract and its preparation and Application

The invention discloses a chrysanthemum echinaceae antigen, a preparation method and application thereof, including: reaction of chrysanthemum echinaceae with compound B containing amino and carboxyl groups to obtain compound C; reaction of compound C and N_hydroxysuccinimide with dicyclohexyl carbodiimide or 1_ethyl(3_dimethylamino propyl) carbonyl diimide hydrochloride Compound D was obtained by coupling reaction in the presence of salt. Compound D was obtained by coupling reaction with carrier protein. The antigen was used in the preparation of ELISA kit, ELISA kit or immunoaffinity chromatography column for the detection of keratin in samples. The invention has the advantages of convenient and quick obtaining the antigen of Chuan Chen skin element, concise and clear synthesis steps, low synthesis cost and good effect. The specificity of the antibody obtained from the immunization with the extract of low temperature is low.

【技术实现步骤摘要】
川陈皮素抗原及其制备方法与应用
本专利技术涉及化合物制备与应用
，特别涉及一种川陈皮素抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
川陈皮素通用名为Nobiletin；化学名为：柚皮素7-鼠李糖苷；商品名为：川皮苷、川皮亭、蜜橘黄素；CAS登记号:478-01-3；分子式为：C21H22O8；相对分子量为：402.13。其化学结构式如下：川陈皮素(Nobiletin)具有抗氧化活性而且可以抑制肿瘤细胞的生长，其中川陈皮素对Hela细胞、THP-1细胞、Colon26细胞、S180细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较好的抑制作用。关于川陈皮素抗癌作用的机制研究逐渐深入,研究发现川陈皮素直接抑制MEK活性,从而抑制ERK磷酸化,抑制MMP表达,达到抗癌作用。此外，川陈皮素还有拮抗哮喘炎症，抗肝炎C型病毒，预防心脏病发作、糖尿病、中风和抵御肥胖症等作用。它在骨代谢中也具有调节作用:可以抑制破骨细胞分化及前列腺素E2(PGE2)的生成。目前，川陈皮素提取方法主要有超声提取法、索氏提取法、响应面法优化超声提取、固相分散萃取法、高速逆流色谱法等。川陈皮素含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、RP-HPLC法、HPLC-ESI-MS/MS法、HPLC-DAD，其灵敏度高，准确性好，但是这几种检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种川陈皮素抗原及其制备方法与应用，能有效的解决上述现有技术存在的问题。为了实现以上专利技术目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种川陈皮素抗原，其结构通式如式A所示，式A结构式所述式A中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。一种川陈皮素抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1，将川陈皮素与式B所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式C所示化合物；H2N-X-(CH2)n-COOH式B结构式式C结构式所述式B和式C中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数。步骤2，式C所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式D所示化合物；式D结构式所述式D中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数。步骤3，式D所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示川陈皮素抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。作为优选，步骤1中，式B所示化合物选自羧甲氧基胺、肼基乙酸、氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中至少一种。作为优选，所述步骤1中，式B化合物和川陈皮素的投料摩尔配比可为(0.1-10)：1反应的温度可为0～100℃，时间可为6～48小时；反应的溶剂选自吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。作为优选，所述步骤2中，式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比可为1：(1～5)：(1～5)；式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比可为1：(1～5)：(1～5)；所述偶联反应的温度可为0～50℃，时间可为4～24小时。作为优选，步骤3中，式D所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比可为(5～30)：1；所述偶联反应的温度可为0～50℃，时间可为8～36小时；所述偶联反应在pH值为5～9的条件下进行；式D所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均可为7.4；作为优选，步骤3之后，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值可为4～10、浓度可为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。作为优选，所述川陈皮素抗原是川陈皮素与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式C上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。一种基于上述川陈皮素抗原的应用，包括：在制备用于检测样品中川陈皮素的酶联免疫试剂盒、川陈皮素的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。作为优选，所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。与现有技术相比本专利技术的优点在于：能够方便、快捷地获得川陈皮素抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。本专利技术方法制备的川陈皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本专利技术的制备川陈皮素抗原的方法及由该方法获得的川陈皮素抗原在川陈皮素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。附图说明图1为川陈皮素抗原的合成路线图；图2为建立的川陈皮素间接ELISA法标准曲线。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图并列举实施例，对本专利技术做进一步详细说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺(OPD)，羧甲氧基胺半盐酸盐、川陈皮素等其余常规试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实施例1、川陈皮素-卵清白蛋白(川陈皮素-OVA)抗原的制备合成路线图如图1所示。1)式I所示化合物的合成在50mL三口瓶中，加入0.3g川陈皮素和0.2g羧甲氧基胺半盐酸盐，然后加入15mL吡啶，加热至100度，反应24h后冷却至室温，将反应液倒入100mL水中，用浓盐酸调节pH值为3，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，无水硫酸钠干燥，旋转脱溶，柱层析得到产物0.2g，产率56％。1HNMR(600MHz,dmso)δ12.70(s,1H),7.48(d,J＝8.3Hz,1H),7.36(s,1H),7.09(d,J＝8.5Hz,1H),7.05(s,1H),4.63(s,2H),3.93(s,3H),3.89(s,3H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.79(s,3H),3.63(s,3H).13CNMR(151MHz,dmso)δ171.97,153.34,151.40,149.28,148.67,146.58,144.52,144.11,142.98,138.31,124.42,119.01,112.23,108.82,108.70,92.01,70.86,62.02,61.80,61.76,60.88,56.06,55.97.ESI-MSm/z476.02[M+H]+,498.49[M+Na]+。产品经1H-NMR、13C-NMR和质谱确证，为式I所示川陈皮素半抗原化合物。2)偶联反应方法(1)：称取步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种川陈皮素抗原，其特征在于：结构通式如式A所示，

【技术特征摘要】
1.一种川陈皮素抗原，其特征在于：结构通式如式A所示，式A结构式所述式A中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。2.根据权利要求1所述的一种川陈皮素抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将川陈皮素与式B所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式C所示化合物；H2N-X-(CH2)n-COOH式B结构式式C结构式所述式B和式C中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；步骤2，式C所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式D所示化合物；式D结构式所述式D中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；步骤3，式D所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示川陈皮素抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，式B所示化合物选自羧甲氧基胺、肼基乙酸、氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中至少一种。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，式B化合物和川陈皮素的投料摩尔配比可为(0.1-10)：1反应的温度可为0～100℃，时间可为6～48小时；反应的溶剂选自吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，式C所示化合物、N-羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔永亮，焦必宁，赵静，赵其阳，张耀海，陈爱华，王成秋，何悦，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50