螺虫乙酯抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及化合物制备与应用技术领域，特别涉及一种螺虫乙酯抗原及其制备方法与应用，结构通式

Antigen of spiro ethyl ester and its preparation and Application

The invention relates to the technical field of compound preparation and application, in particular to a snail ethyl ester antigen, its preparation method and application, and general formula of structure.

【技术实现步骤摘要】
螺虫乙酯抗原及其制备方法与应用
本专利技术涉及化合物制备与应用
，特别涉及一种螺虫乙酯抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
螺虫乙酯(spirotetramat)是由德国拜耳公司开发研制的新颖内吸型季酮酸类杀虫剂，属于高效广谱杀虫剂，可有效防治各种刺吸式口器害虫。螺虫乙酯为低毒性杀虫剂，在土壤中易降解，可有效防治木虱、粉虱、介壳虫、棉盲蝽等害虫。其化学结构式如下：2007年10月，拜耳公司在英国格拉斯哥植保会议上介绍了螺虫乙酯，2007年底，螺虫乙酯在突尼斯获准在全球的首个登记。2008年，拜耳在美国和加拿大登记并上市了螺虫乙酯，继而在哥伦比亚、墨西哥、土耳其和新西兰等国家登记上市。2011年3月16日，螺虫乙酯在中国正式登记上市。螺虫乙酯的销售额逐年上升，从2008年的不足0.3亿美元已经上升到2012年为1.40亿美元。随着螺虫乙酯的大量使用，其残留问题也引起人们的关注。虽然螺虫乙酯属于低毒性杀虫剂，但是从环境安全性评价来说，螺虫乙酯难挥发、难光解，在土壤中可以被降解，但是其降解产物在土壤中有一定的移动性，很容易交叉污染。目前，螺虫乙酯在农产品中的残留检测方法主要是高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)尽管仪器法检测具有灵敏度高、准确可靠等优点，但样品前处理繁琐，检测时间长，耗资大，技术性要求高，且仪器昂贵，不适合大量样品的快速检测，也不具备现场快速检测的能力。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。专利
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种螺虫乙酯抗原及其制备方法与应用，能有效的解决上述现有技术存在的问题。为了实现以上专利技术目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种螺虫乙酯抗原，其结构通式如式A所示，所述式A中，X为CH2、CO基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。该螺虫乙酯抗原的制备方法，螺虫乙酯抗原是螺虫乙酯与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式C上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。包括如下步骤：步骤1，将螺虫乙酯水解得到式B所示化合物；步骤2，将式B化合物与式C所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式D所示化合物；Y-X-(CH2)n-COOH式C结构式所述式C和式D中，X为CH2、CO基团中的一种，Y为Cl、Br和I基团中的一种，n为0-6的整数；步骤3，式D所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式E所示化合物；所述式E中，X为CH2、CO基团中的一种，n为0-6的整数；步骤4，式E所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示螺虫乙酯抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。作为优选，步骤2中，式C所示化合物选自氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、氯丙酸、溴丙酸、碘丙酸、氯丁酸、溴丁酸、碘丁酸中至少一种。作为优选，所述步骤2中，式B化合物式和C化合物的投料摩尔配比为0.1-10：1，反应的温度为0～100℃，时间为3～48小时；反应的溶剂选自吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。作为优选，所述步骤3中，式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比为1：1～5：1～5；式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比为1：1～5：1～5；所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为4～24小时。作为优选，步骤3中，式E所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比为5～30：1；所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为4～36小时；所述偶联反应在pH值为5～9的条件下进行；式E所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.4。作为优选，步骤4之后，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为4～10、浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。基于上述螺虫乙酯抗原的应用，包括：在制备用于检测样品中螺虫乙酯的酶联免疫试剂盒、螺虫乙酯的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。与现有技术相比本专利技术的优点在于：能够方便、快捷地获得螺虫乙酯抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。本专利技术方法制备的螺虫乙酯抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本专利技术的制备螺虫乙酯抗原的方法及由该方法获得的螺虫乙酯抗原在螺虫乙酯的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。附图说明图1为实施例建立的螺虫乙酯间接ELISA法标准曲线。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图并列举实施例，对本专利技术做进一步详细说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，单组分TMB显色液，溴乙酸、螺虫乙酯等其余常规试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实施例1、螺虫乙酯-卵清白蛋白(螺虫乙酯-OVA)抗原的制备合成路线：1)式I所示化合物的合成在100mL圆底烧瓶中加入1.5g螺虫乙酯和0.65gNaOH，加入20mL甲醇和4mL水，25℃下搅拌4h后，将反应液倒入100mL水中，用浓盐酸调节pH值为3，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，无水硫酸钠干燥。旋转脱溶，将得到的产物用正己烷和乙酸乙酯(3:1,v/v)重结晶，得白色固体0.88g，产率73％。1HNMR(600MHz,dmso)δ7.96(s,1H),7.04(d,J＝7.7Hz,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.87(s,1H),3.24(s,3H),3.09(t,J＝10.7Hz,1H),2.22(s,3H),2.07(s,3H),1.92(m,4H),1.49(q,J＝11.3Hz,2H),1.38(d,J＝12.4Hz,2H).13CNMR(151MHz,dmso)δ178.56,172.39,134.64,133.93,131.99,131.54,129.71,127.76,93.27,78.10,59.64,55.34,32.61,28.05,20.97,19.69.ESI-MSm/z302.13[M+H]+。产品经1H-NMR、13C-NMR和质谱确证，为式I所示化合物。2)式Ⅱ所示化合物的合成在50mL三口瓶中加入式I所示化合物0.45g，加入20mLDMF使其溶解，滴加入溴乙酸0.3g，加入NaOH0.2g，搅拌加热至100度，反应24h。将反应液冷去至室温，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种螺虫乙酯抗原，其特征在于，结构通式如式A所示，

【技术特征摘要】
1.一种螺虫乙酯抗原，其特征在于，结构通式如式A所示，所述式A中，X为CH2、CO基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。2.根据权利要求1所述的一种螺虫乙酯抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将螺虫乙酯水解得到式B所示化合物；步骤2，将式B化合物与式C所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式D所示化合物；Y-X-(CH2)n-COOH式C结构式所述式C和式D中，X为CH2、CO基团中的一种，Y为Cl、Br和I基团中的一种，n为0-6的整数；步骤3，式D所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式E所示化合物；所述式E中，X为CH2、CO基团中的一种，n为0-6的整数；步骤4，式E所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示螺虫乙酯抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。3.根据权利要求2所述的一种螺虫乙酯抗原的制备方法，其特征在于，步骤2中，式C所示化合物选自氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、氯丙酸、溴丙酸、碘丙酸、氯丁酸、溴丁酸、碘丁酸中至少一种。4.根据权利要求2所述的一种螺虫乙酯抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，式B化合物式和C化合物的投料摩尔配比为0.1-10：1；反应的温度为0～100℃，时间为3～...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔永亮，焦必宁，叶玉凤，赵其阳，张耀海，陈爱华，何悦，王成秋，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50