本发明专利技术属生物技术和制药技术领域，涉及一种基于OMCN的高效灵敏的配体门控诊疗体系的制备方法，本发明专利技术通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，可实现体内外的肿瘤多重诊断及治疗，本发明专利技术的基于OMCN的配体门控诊疗体系，检测限低，可应用于MUC1分子、肿瘤细胞和活体肿瘤组织不同水平上的检测和治疗，确保诊断真实可靠，治疗靶向高效。本发明专利技术提供了一种经济实用简单的基于OMCN的配体门控诊疗体系的制备技术，可实现体内外的肿瘤多重诊断及治疗。
Construction of a ligand gated diagnostic system and its application in real-time tumor response
The invention belongs to the field of biotechnology and pharmaceutical technology, and relates to a preparation method of an efficient and sensitive ligand-gated diagnostic and therapeutic system based on OMCN. By specifically combining with MUC1 highly expressed on the surface of malignant tumors, the invention can realize multiple diagnosis and treatment of tumors in vivo and in vitro. The ligand-gated diagnostic and therapeutic system based on OMCN of the invention can realize multiple diagnosis and treatment of tumors in vivo and in vitro The system has low detection limit and can be applied to the detection and treatment of MUC1 molecule, tumor cells and living tumor tissues at different levels to ensure the authenticity and reliability of diagnosis and high targeting efficiency of treatment. The invention provides an economical, practical and simple preparation technology of ligand gated diagnosis and treatment system based on OMCN, which can realize multiple diagnosis and treatment of tumors in vivo and in vitro.
【技术实现步骤摘要】
一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用
本专利技术属生物技术和制药
，涉及载药系统，具体涉及一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用。
技术介绍
资料显示，近年来，虽然人们对于肿瘤这一重大疾病的处理投入了大量的科研力量，肿瘤患者的死亡率仍然未得到显著性的改善。目前临床实践中对于肿瘤的治疗仍然囿于诊断和治疗分离的模式，调查显示，假阳性/阴性诊断、晚期诊断、肿瘤转移、脱靶副作用等缺陷仍然存在。事实上，基于实时诊断的靶向可控/按需给药是一种理想的肿瘤治疗模式，可以实现肿瘤的早期、高效诊断，将药物精准递送到肿瘤区域，最大化减少非靶向递送导致的机体副作用，同时实现基于肿瘤发展程度的可控、按需释药。这一理想的纳米肿瘤诊疗平台的搭建，是目前肿瘤靶向诊疗领域的研究热点。研究报道，基于荧光共振能量转移的生物传感器，特别是荧光猝灭-恢复型传感器，由于其高灵敏度、低背景噪音、强抗干扰能力等特性，是一种灵敏、可行的肿瘤诊断途径；而具有高生物相容且孔径可调的介孔纳米材料是目前肿瘤递药的有效载体；将荧光猝灭-恢复型传感器与介孔纳米递药系统相结合，可以实现肿瘤高效的诊疗。然而由于普遍使用的介孔硅纳米粒的光学透明性，唯有通过进一步的表面或孔道修饰才可使得结合的荧光探针淬灭，这不仅增加了合成复杂性及降低了临床应用的潜力，也增加了药物载入(诊疗结合)的困难程度。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用，本专利技术将有助于特异性原位高效诊断粘蛋白过表达的肿瘤，实现靶向、、肿瘤发展程度的按需释药，起到更好的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于现有技术的现状，提供一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用，本专利技术的配体门控诊疗体系通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，实现肿瘤实时响应的诊断和治疗。本专利技术基于介孔碳球及特定序列的单链核苷酸(P0)，构建了一种配体门控的载药系统，门控P0可被多数恶性肿瘤细胞表面高度表达的粘蛋白(MUC1)特异性解吸附，实现诊断及靶向递药的功能；该纳米门控诊疗平台，可特异性原位高效诊断粘蛋白过表达的肿瘤，实现靶向、肿瘤发展程度(粘蛋白浓度响应)的按需释药，并且氧化介孔碳球还具有pH响应的释药性质，结合肿瘤微酸性环境条件能起到更好的治疗效果。具体的，本专利技术所述的配体门控诊疗体系，以氧化介孔碳纳米球OMCN为支撑，负载抗肿瘤药物阿霉素(Dox)，表面通过π-π非共价作用覆盖单链DNA门控。本专利技术制备所述配体门控诊疗体系的步骤如下：介孔碳纳米球使用强酸混合物处理，超声，搅拌，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN，适量OMCN和Dox混合，搅拌6h，透析，进一步与P0混合，摇床振摇，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，储存备用。上述制备方法中，合成OMCN时所述强酸混合物为硫酸和硝酸的混合物，体积比为2～4:1。上述方法中，合成OMCN时，超声方式为普通超声和超声破碎仪超声。上述方法中，合成OMCN时，超声时间为0.5～4h。上述方法中，合成OMCN时，搅拌温度为30～70℃。上述方法中，合成OMCN时，搅拌时间为0.5～4h。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN的浓度范围是5～800μg/mL。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，DOX的浓度是20μg/mL。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN与Dox的搅拌混合时间为0.5～6h。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN与Dox的搅拌速率为300rpm。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，P0的浓度范围是40～4000nmol/L。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，Dox-OMCN与P0的搅拌混合时间为1h。上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，Dox-OMCN与P0的搅拌速率为300rpm。上述方法中，所得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的适宜储存温度为4～25℃。本专利技术使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系检测的溶液体系为PBS溶液(pH＝5.0或7.4)和含10％血浆的PBS溶液(pH＝7.4)。本专利技术使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系检测的目标对象为MUC1分子、肿瘤细胞和活体肿瘤组织。本专利技术使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系治疗的目标对象为肿瘤细胞和荷乳腺癌瘤鼠。本专利技术通过多种方法对所制备的OMCN进行表征，表征方法包括：扫描电镜、透射电镜。本专利技术使用荧光光谱仪考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的线性范围和检测限，Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与含有MUC1的不同溶液体系(PBS5.0,PBS7.4或含10％血浆的PBS7.4溶液)，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察线性范围和检测限。结果显示，本专利技术所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在不同溶液中的线性范围为1.06–10.6μM，其中在PBS溶液(pH5.0)中检测限为101nM。本专利技术进一步使用InfiniteM1000Pro酶标仪考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的线性范围和检测限。Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1PBS溶液(pH5.0)孵育10h，使用InfiniteM1000Pro酶标仪检测溶液荧光，考察线性范围和检测限，本专利技术所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH5.0)中的线性范围为0.10–5.3μM，检测限为17.5nM。本专利技术使用共聚焦显微镜考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对肿瘤细胞的选择特异性。Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与人乳腺癌MCF-7细胞和乳腺上皮MCF-10A细胞孵育0h、4h、8h和12h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着时间逐渐增强，而乳腺上皮MCF-10A细胞几乎无荧光，表明本专利技术所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺癌细胞有很好的选择特异性响应。本专利技术使用共聚焦显微镜考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对MUC1不同表达程度肿瘤细胞的选择特异性，Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与人乳腺癌MCF-7细胞及添加不同浓度MUC1多肽(1.06μM，2.12μM，4.24μM，6.36μM，8.48μM，10.6μM)的MCF-7细胞孵育8h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着体系MUC1浓度增加逐渐增强，表明本专利技术所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对MUC1不同表达程度的乳腺癌细胞有很好的选择特异性响应。本专利技术使用CCK8细胞凋亡试剂检测Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在MCF-7肿瘤细胞及MCF-10A中的治疗效果，不同浓度的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种配体门控诊疗体系，其特征在于，以氧化介孔碳纳米球OMCN为支撑，表面通过π‑π非共价作用连接覆盖单链DNA门控，制成氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系。的构建方法一种氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系的制备方法，其特征在于通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，实现体内外的肿瘤多重诊断。
【技术特征摘要】
1.一种配体门控诊疗体系，其特征在于，以氧化介孔碳纳米球OMCN为支撑，表面通过π-π非共价作用连接覆盖单链DNA门控，制成氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系。的构建方法一种氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系的制备方法，其特征在于通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，实现体内外的肿瘤多重诊断。2.权利要求1所述的配体门控诊疗体系的制备方法，其特征在于，其包括步骤：介孔碳纳米球使用强酸混合物处理，超声，搅拌，离心，水洗，干燥，制得氧化介孔碳纳米球OMCN；适量Dox-OMCN与P0混合，混匀搅拌，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，储存备用。3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时所述强酸混合物为硫酸和硝酸的混合物，体积比为2～4:1。4.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时，超声方式为普通超声和超声破碎仪超声。5.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时，超声时间为0.5～4h，搅拌温度为30...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄容琴，王义，李诚意，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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