一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，本发明专利技术涉及一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用，基于负载金纳米粒子的多孔钯复合材料构建的电化学免疫传感器，用于定量检测癌胚抗原含量，具有特异性强，灵敏度高，检测限低的优点，对癌症的早期诊断具有重要的科学意义和应用价值。

Preparation and application of a gold palladium complex nano enzyme immunosensor

The invention belongs to the field of novel nanocomposite materials, immunoassay and biosensor technology. The invention relates to a preparation method and application of an unmarked gold-palladium composite nanoenzyme immunosensor. An electrochemical immunosensor based on a porous palladium composite material loaded with gold nanoparticles is used for quantitative detection of carcinoembryonic antigen. It has the advantages of high specificity, high sensitivity and low detection limit. It has important scientific significance and application value for early diagnosis of cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感
，提供了一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法，应用于癌胚抗原的检测。
技术介绍
癌症是全球最严重的健康问题之一，癌胚抗原是高度糖基化的蛋白质，由大肠癌组织产生，作为抗原可引起患者的免疫反应，癌胚抗原在许多恶性肿瘤的存在下含量会升高，如胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌等。癌胚抗原浓度的精确检测对癌症的早期诊断具有重要意义。因此，发展高灵敏的癌胚抗原的定量检测方法尤为迫切。近年来，随着临床诊断技术的飞速发展，性能优越的电化学免疫传感器脱颖而出，并被广泛应用于病毒标志物或肿瘤标志物的检测中。无标记型电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点，对痕量级病毒和肿瘤标志物的检测具有重要价值。基底材料和催化剂材料作为电化学免疫传感器的重要组分，对提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用。近年来，纳米材料及其复合材料被广泛应用于免疫传感器的构建当中。本专利技术利用层层自组装技术，以负载金纳米粒子的多孔钯同时作为基底材料和催化剂材料，构建的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器，具有检测范围广、检测下限低、操作简单、检测速度快等优点，对癌症的早期诊断具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用，实现了对癌胚抗原的超灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器用于癌胚抗原的检测。本专利技术的技术方案，包括以下步骤：1.一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为3.0~5.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；（2）将6.0µL、0.5~2.0mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；（3）将6.0µL、5~15µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中干燥；（4）继续将3.0µL、1~2mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中晾干；（5）继续滴加6.0µL、0.01pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0℃冰箱中干燥，制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。2.一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法，所述相关材料的制备，步骤如下：（1）金纳米粒子溶液的制备在室温下，将1.0~2.0mL、1.0wt%的氯金酸溶液加入到99.0mL超纯水中，依次加入7.7~15.4mg谷胱甘肽，3.0~6.0mL甲醇，0.5~1.0mL乙酸，搅拌5min，快速加入1.5~3.0mL现配制的20mg/mL的硼氢化钠溶液，继续搅拌2h，得到金纳米粒子的水分散系；（2）多孔钯的制备在室温下，将20~40mL、0.5g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到10~20mL、2g/L的罗丹明B碱溶液中，磁力搅拌5min后，逐滴滴加2~4mL、10wt%的抗坏血酸溶液，继续搅拌30min，得到多孔钯的水分散系；（3）Au@Pd纳米粒子的制备取1.0~1.5mL、12wt%的多孔钯纳米粒子置于20mL烧杯中，加入1.0~1.5mL、12wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，持续搅拌30min，超声20min后，离心，用超纯水洗涤，继续加入1.0~1.5mL、1.0mol/mL的金纳米粒子后，搅拌均匀，超声20min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的溶液离心洗涤，得到Au@Pd纳米粒子分散液。3.一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备，用于癌胚抗原的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL包含5.0mmol/L过氧化氢溶液的pH5.29~8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；（3）记录不同浓度下的癌胚抗原所对应的电流峰值；（4）利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原的浓度。本专利技术的有益成果（1）本专利技术利用金纳米粒子能够有效增加电极表面的电子传递效率，并且，由于金纳米粒子具有良好的生物相容性，能够稳定结合大量的具有活性的捕获抗体，从而增加免疫传感器的稳定性，对于提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用，有辣根过氧化物酶活性的金纳米粒子和多孔钯纳米粒子，催化性能和导电性能极佳的多孔钯和金纳米粒子结合后，有效增强了导电性，通过这种协同作用和优势互补作用，增大免疫传感器的灵敏度；（2）一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器对癌胚抗原的检测，其对癌胚抗原检测范围是0.01pg/mL~100ng/mL，最低检测下限为0.1fg/mL；表明一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器可以达到精确定量检测癌胚抗原的目的。具体实施方式现将本专利技术通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。实施例1一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法（1）将直径为3.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；（2）将6.0µL、0.5mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；（3）将6.0µL、5.0µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中干燥；（4）继续将3.0µL、1.0mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中晾干；（5）继续滴加6.0µL、0.01pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0℃冰箱中干燥，制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。实施例2一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法（1）将直径为4.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；（2）将6.0µL、1.0mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；（3）将6.0µL、10.0µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中干燥；（4）继续将3.0µL、1.5mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中晾干；（5）继续滴加6.0µL、0.01pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0℃冰箱中干燥，制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。实施例3一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）Au@Pd纳米粒子的制备：将单独制备的金纳米粒子和钯纳米粒子结合；（2）构建无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器，测定癌胚抗原含量，绘制工作曲线。

【技术特征摘要】
1.一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）Au@Pd纳米粒子的制备：将单独制备的金纳米粒子和钯纳米粒子结合；（2）构建无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器，测定癌胚抗原含量，绘制工作曲线。2.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的Au@Pd纳米粒子的制备具体如下：①金纳米粒子溶液的制备在室温下，将1.0~2.0mL、1.0wt%的氯金酸溶液加入到99.0mL超纯水中，依次加入7.7~15.4mg谷胱甘肽，3.0~6.0mL甲醇，0.5~1.0mL乙酸，搅拌5min，快速加入1.5~3.0mL现配制的20mg/mL的硼氢化钠溶液，继续搅拌2h，得到金纳米粒子的水分散系；②多孔钯的制备在室温下，将20~40mL、0.5g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到10~20mL、2g/L的罗丹明B碱溶液中，磁力搅拌5min后，逐滴滴加2~4mL、10wt%的抗坏血酸溶液，继续搅拌30min，得到多孔钯的水分散系；③Au@Pd纳米粒子的制备取1.0~1.5mL、12wt%的多孔钯纳米粒子置于20mL烧杯中，加入1.0~1.5mL、12wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，持续搅拌20~40min，超声15~20min后，离心，用超纯水洗涤，继续加入1.0~1.5mL、1.0mol/mL的金纳米粒子后，搅拌均匀，超声15~20min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的溶液离心洗涤，得到Au@Pd纳米粒子分散液。3.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的构建无标记型电化学免疫传感器，具体如下：（1）将直径为3.0~5.0mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青，谭召灵，刘会，颜芹，董慧，董云会，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37