快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib敏感性的方法技术

本发明专利技术提供一种能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法。通过本发明专利技术的方法能快速的预测BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性并提高BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性。

Rapid prediction and enhancement of sensitivity of BRCA1/2 wild type ovarian cancer cells to Olaparib

The invention provides a method for rapidly predicting and improving the sensitivity of BRCA1/2 wild-type ovarian cancer cells to PARP1 inhibitors. The method can quickly predict the sensitivity of BRCA1/2 wild-type ovarian cancer patients to PARP1 inhibitors and improve the sensitivity of BRCA1/2 wild-type ovarian cancer patients to PARP1 inhibitors.

【技术实现步骤摘要】
快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib敏感性的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂Olaparib抑制剂敏感性的方法。
技术介绍
PARP1(Poly(ADP-Ribose)Polymerase1，多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶1)抑制剂是目前卵巢癌治疗中最主要、最有效的靶向药物。2014年年底，美国FDA批准了第一个PARP1抑制剂Olaparib用于晚期卵巢癌的治疗。2016年5月，另一个PARP1抑制剂Niraparib在美国上市，也用于卵巢癌的治疗。然而，PARP1抑制剂主要用于BRCA1/2(乳腺癌1号/2号基因)发生突变的卵巢癌病人，因为前期的研究表明，PARP1抑制剂在具有BRCA1/2突变的卵巢癌细胞中的作用较其在BRCA1/2野生型的卵巢癌细胞的作用更为明确，不同的BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的反应差异非常大。在临床上，超过70％的卵巢癌是BRCA1/2野生型的。目前缺乏在BRCA1/2野生型的卵巢癌细胞中筛选出对PARP1抑制剂敏感的细胞类型的检测方法，也缺乏增强BRCA1/2野生型的卵巢癌病人对PARP1抑制剂敏感性的方法。非折叠蛋白质相应通路(unfoldedproteinresponse，UPR)是一系列在进化中非常保守的旨在维持细胞内质网(EndoplasmicReticulum，ER)中蛋白质合成后正确折叠并形成功能性构象的信号传导通路。其中，UPR的一个关键分支通路是由内质网膜蛋白偶联的PERK蛋白引发的：当被上游信号激活后，PERK自身磷酸化，继而磷酸化其直接的下游分子eIF2α，后者则增强转录因子ATF4的翻译，ATF4最终进入细胞核启动相关的基因转录，包括CHOP、ASNS和GADD34等，引起细胞存活或者凋亡的效应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂抑制剂敏感性的方法。通过本专利技术的方法能快速的预测BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性并提高BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性。本专利技术提供的技术方案如下所述。一种能快速预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，通过检测细胞UPR中PERK通路的激活水平，即eIF2a蛋白的磷酸化程度和ATF4蛋白的表达水平来预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的敏感性。本专利技术的另一目的是提供一种提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，通过抑制UPR中PERK通路的激活水平来提升BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib抑制剂的敏感性。附图说明图1是本专利技术实施例中1的结果图；图2是本专利技术实施例中2的结果图；图3是本专利技术实施例中3的结果图；图4是本专利技术实施例中4的结果图；图5是本专利技术实施例中5的结果图；图6是本专利技术实施例中6的结果图；图7是本专利技术实施例中7的结果图。具体实施方式下面给出本专利技术的较佳的实施例，这些实施例并非限制本专利技术的内容。实施例1在体外细胞培养条件下，用“浓度—效应”法测定8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞系对Olaparib处理的半致死浓度(EC50)。实验方法：1.8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞OVCA1，OVCA2，OVCA3，OVCA4，OVCA5，OVCA6，OVCA7和OVCA8用RPMI-1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％CO2。Olaparib(SelleckChem公司)用DMSO进行溶解，储存液浓度为10mM。2.在96孔细胞培养板上，以4000细胞/孔的密度种植8株细胞。在细胞种植24小时后，对细胞进行Olaparib的处理，浓度为40μM，20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.31μM和0μM(DMSO)。处理72小时后，用CellTiterGlo(Promega公司)试剂进行细胞活性测定，用Prism软件进行“浓度—效应”的计算，得出8株细胞对Olaparib处理的半致死浓度(EC50)。实验结果：见图1。实施例2通过蛋白质印迹技术(Westernblotting)，获得8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞系中eIF2α磷酸化，ATF4表达水平和内参GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的数据。然后把上述蛋白的表达量和各自细胞株对的EC50浓度进行相关性分析，发现磷酸化eIF2α和ATF4的水平与细胞对Olaparib的EC50呈显著相关：eIF2α磷酸化水平越高，ATF4的表达水平越高，BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib的敏感性越低(EC50越高)。实验方法：1.8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞OVCA1，OVCA2，OVCA3，OVCA4，OVCA5，OVCA6，OVCA7和OVCA8用RPMI1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％CO2。Olaparib用DMSO进行溶解，储存液浓度为10mM。2.用标准的RIPA缓冲液(20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA(Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid)，1％NP-40，1％sodiumdeoxycholate(脱氧胆酸钠)，2.5mMsodiumpyrophosphate(焦磷酸钠)，1mMbeta-glycerophosphate(β-甘油磷酸钠)，1mMNa3VO4(钒酸钠)，1μg/mlleupeptin(亮抑蛋白酶肽)，1mMPMSF(Phenylmethanesulfonylfluoride))在冰上收集上述8株细胞的细胞裂解液。用Bradford方法测定上述裂解液的蛋白质浓度，并用RIPA缓冲液(Abcam公司)，350mMDTT(DL-Dithiothreitol)，25％glycerol，2％SDS，0.01％BromophenolBlue(溴酚蓝BPB)配成1μg/μl的蛋白裂解液。75℃加热10分钟。3.用蛋白印记技术(WesternBlotting)法对上述8株细胞的蛋白样本中的eIF2a磷酸化水平，eIF2a表达水平，ATF4表达水平和GAPDH表达水平进行测定。1)用SDS-PAGE法(分离胶浓度为10％)进行蛋白质的分离；2)把蛋白转移到硝酸纤维膜上；3)用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液在室温封闭1小时；4)一抗孵育：抗磷酸化eIF2α(Cellsignalingtechnology#9721)，抗ATF4(CellSignalingtechnology#11815)，抗GAPDH抗体在4℃孵育12小时；5)用与上述一抗相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗进行室温孵育1小时。6)用SuperSignalTMWestPico化学发光底物进行显色本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能快速预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，其特征在于，通过检测细胞UPR中PERK通路的激活水平，即eIF2a蛋白的磷酸化程度和ATF4蛋白的表达水平来预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的敏感性。

【技术特征摘要】
2017.04.21 CN 201710263923X1.一种能快速预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，其特征在于，通过检测细胞UPR中PERK通路的激活水平，即eIF2a蛋白的磷酸化程度和A...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯宇雄，高晓飞，
申请(专利权)人：江苏希摩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32