一种宫颈癌筛查检测试剂盒制造技术

发明专利技术人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki‑67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP‑Red染色液和DAB染色液，所述AP‑Red染色液的制备方法，包括色原制备、底物制备、染色液制备。上述技术方案提供了一种新型的宫颈癌筛查检测试剂盒，该试剂盒使用了新配方的AP‑Red染色液，可能是该染色液中的色原具有多个反应基团，这些基团可以和组织上的基团进行反应，形成共价键，使得使用该试剂盒的宫颈细胞薄片可在染色后直接过有机试剂，不需使用水性封片剂封片，避免产生气泡，厚度得到控制，节约了时间和人力成本，避免影响染色结果的观察，提高了检测效率和检测质量。

A cervical cancer screening test kit

The inventor provides a cervical cancer screening and detection kit, which comprises a p16/Ki_67 mixed primary antibody, a mixed enzyme-labeled secondary antibody and a dyeing solution. The dyeing solution includes an AP_Red dye solution and a DAB dye solution. The preparation method of the AP_Red dye solution includes a chromogen preparation, a substrate preparation, and a dye solution preparation. The technique provides a new kit for cervical cancer screening. The kit uses a new formulation of AP Red staining solution. It is possible that the chromogen in the staining solution has multiple reaction groups, which can react with the groups on the tissue to form covalent bonds that enable the use of the kit in cervical cells. The thin sheet can be dyed directly by organic reagent without using water-based sealing agent. The thickness of the thin sheet can be controlled. The time and manpower cost can be saved, the observation of dyeing result can be avoided, and the detection efficiency and quality can be improved.

【技术实现步骤摘要】
一种宫颈癌筛查检测试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，特征涉及一种宫颈癌筛查检测试剂盒。
技术介绍
据不完全统计，中国每年有13万新发病例，2-3万女性可能死于宫颈癌。我国宫颈癌的新发病例占全世界新发病例的28％，中国的宫颈癌防治任重而道远。细胞学检查是目前宫颈癌的主要筛查方法,p16/Ki-67细胞学双重染色是新近发展的宫颈癌筛查技术，其高灵敏度和特异性极大改善了宫颈癌筛查分流管理。AP-Red染色液是免疫细胞化学中常用的染色液。免疫反应中，抗体所带的碱性磷酸酶与AP-Red染色液起反应，最终使细胞薄片中抗原位点上呈现红色着色。在显色完成后，要对细胞薄片进行封片保存。由于目前普通的AP-Red遇到有机溶剂(乙醇、二甲苯)会褪色，因此需要用水性封片剂封片，若要让染色结果长期保存，待水性封片剂干片后再用中性树胶封片。水性封片剂封片容易产生气泡，有一定厚度，存在折光度问题，一定程度影响染色结果的观察，对检测结果造成不确定性的因素，同时水性封片剂耗时费力，给操作人员增加负担，影响检测的效率。另外，水性封片剂封片后如果没有再次用中性树胶封片，AP-Red的所染的红色会在3-5个月后逐渐褪色。
技术实现思路
为此，需要提供一种检测简单，提高检测效率和质量的宫颈癌筛查检测试剂盒。为实现上述目的，专利技术人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki-67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP-Red染色液和DAB染色液，所述AP-Red染色液的制备方法，包括以下步骤：色原制备：3.5-3.7g新品红溶解于45-55ml质量百分比为1.5％-2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2-2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0-5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP-Red色原溶液；底物制备：0.2-0.4g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于40-60mlpH8.2-8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4-0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP-Red底物溶液；染色液制备：将AP-Red色原溶液与等体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。进一步地，所述色原制备步骤中，所述重氮化反应在冰水浴中进行。进一步地，所述色原制备步骤中，所述亚硝酸钠在25-35min内缓慢加入。进一步地，所述底物制备步骤中，Tris缓冲液的质量百分比浓度为18％-25％。进一步地，还包括加入Tween-20，在所述底物制备步骤中，向第二混合溶液中加入0.14-0.16ml的Tween-20。进一步地，所述p16/Ki-67混合一抗包括：鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体，所述混合酶标二抗包括：连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗。进一步地，所述AP-Red染色液在使用前30分钟内由色原溶液与底物溶液配置。进一步地，所述宫颈癌筛查检测试剂盒用于宫颈细胞薄片。区别于现有技术，上述技术方案提供了一种新型的宫颈癌筛查检测试剂盒，该试剂盒使用了新配方的AP-Red染色液，可能是该染色液中的色原具有多个反应基团，这些基团可以和组织上的基团进行反应并形成共价键，AP-Red染色液与组织的连接力增强,使得使用该试剂盒的宫颈细胞薄片可在染色后直接过有机试剂，不需使用水性封片剂封片，避免产生气泡，厚度得到控制，节约了时间和人力成本，避免影响染色结果的观察，提高了检测效率和检测质量。附图说明图1为使用宫颈癌筛查检测试剂盒的Hela细胞(宫颈癌细胞系)免疫细胞化学染色图；图2为使用市售AP-Red染色液的Hela细胞(宫颈癌细胞系)免疫细胞化学染色图。具体实施方式为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。实施例1：宫颈癌筛查检测试剂盒对宫颈细胞薄片进行免疫细胞化学染色试剂盒包括：p16/Ki-67混合一抗，(鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体)；混合酶标二抗(连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗)；DAB染色液和AP-Red染色液。其中AP-Red染色液的制备包括：色原制备：将3.65g的新品红溶解于50ml质量百分比为1.9％的盐酸溶液中制得第一混合溶液,将第一混合溶液置于0℃冰水浴中，并在30分钟内缓慢加入2.07g的亚硝酸钠，得到第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，去除固体后，得到AP-Red色原溶液；底物制备：将0.3g的萘酚AS-BI磷酸盐加入50mlpH8.4的21％的Tris缓冲液中，混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.5ml的二甲基甲酰胺、0.15ml的Tween-20混合，得到AP-Red底物溶液。染色液制备：将AP-Red色原溶液与同体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。配置好的AP-Red染色液避光存放，30分钟内有效。免疫反应中，抗体所带的碱性磷酸酶与AP-Red底物中的萘酚AS-BI磷酸盐起反应，反应后的物质与AP-Red色原(主要为重氮盐)起反应，最终使细胞切片中抗原位点上呈现红色着色。用宫颈癌筛查检测试剂盒进行Hela细胞(宫颈癌细胞系)的免疫细胞化学染色，试验步骤如下：a)细胞固定宫颈细胞薄片置于95％乙醇中，浸泡30分钟；风干。b)抗原修复抗原修复液隔水加热至95℃；将固定后的细胞薄片置于耐高温染色架上，蒸馏水浸泡湿润，放入95℃抗原修复液中修复20分钟后，自然冷却至室温；流水冲洗1分钟；用PBS溶液冲洗3分钟×2次。c)阻断内源性过氧化物酶除去PBS液，加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟；PBS冲洗3分钟×3次。d)加(p16+Ki-67)混合一抗除去PBS液，加100μl(p16+Ki-67)混合一抗，室温下孵育60分钟；PBS冲洗3分钟×3次。e)加HPR+AP酶标第二抗体(混合酶标二抗)除去PBS液，加100μlHPR+AP酶标第二抗体，室温下孵育15分钟；PBS冲洗3分钟×3次。f)加AP-Red染色液除去PBS液，加100-200μl实施例1配制好的AP-Red染色液，显色10-15分钟，必要时可在显微镜下观察掌握染色时间，阳性染色为红色；PBS冲洗3分钟×3次。g)加DAB显色液除去PBS液，加100-200μl配制好的DAB显色剂，显色5分钟，可在显微镜下观察掌握染色时间，阳性染色为棕黄(褐)色；流水冲洗终止显色。h)复染除去水分，加100-200μl苏木素染色液浅染15-30秒，流水冲洗干净；PBS冲洗返蓝，流水冲洗干净。i)脱水、透明、封片85％乙醇中，浸泡1分钟；95％乙醇中，浸泡1分钟；无水乙醇中，浸泡1分钟；二甲苯透明；中性树胶和盖玻片封片。使用了实施例1中宫颈癌筛查检测试剂盒的Hela细胞(宫颈癌细胞系)的红色染色部位则定位清晰、细胞薄片内见同一细胞细胞质呈红色着色，细胞核呈棕黄色或红褐色着色,具体可见图1。染色片在常温保存3年后色泽依然鲜艳没有出现褪色的情况。而当使用了市售AP-Red染色液代替实施例1配置的AP-Red染色液，配合宫颈癌筛查检测试剂盒的其余组分进行细胞薄片染色，发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki‑67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，其特征在于，所述染色液包括AP‑Red染色液和DAB染色液，所述AP‑Red染色液的制备方法，包括以下步骤：色原制备：3.5‑3.7g新品红溶解于45‑55ml质量百分比为1.5％‑2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2‑2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0‑5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP‑Red色原溶液；底物制备：0.2‑0.4g萘酚AS‑BI磷酸盐溶解于40‑60mlpH8.2‑8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4‑0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP‑Red底物溶液；染色液制备：将AP‑Red色原溶液与等体积的AP‑Red底物溶液进行混合，得到AP‑Red染色液。

【技术特征摘要】
1.一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki-67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，其特征在于，所述染色液包括AP-Red染色液和DAB染色液，所述AP-Red染色液的制备方法，包括以下步骤：色原制备：3.5-3.7g新品红溶解于45-55ml质量百分比为1.5％-2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2-2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0-5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP-Red色原溶液；底物制备：0.2-0.4g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于40-60mlpH8.2-8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4-0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP-Red底物溶液；染色液制备：将AP-Red色原溶液与等体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述色...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨清海，周洪辉，王丹，胡滨阳，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35