同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了同时检测5种甘蔗病毒的多重RT‑PCR检测引物组，包括六对PCR引物，分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。据此，还对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立了相应多重RT‑PCR检测方法，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘蔗组织中同时检测这五种侵染甘蔗的病毒，对健康种苗母株筛选、健康种苗繁育监测、抗病育种和田间病害流行预测均具有重要意义。为方便应用本发明专利技术，还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。

【技术实现步骤摘要】
同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒
本专利技术属于甘蔗病毒检测
，涉及一种同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒。
技术介绍
甘蔗(SaccharumofficinarumL.)属禾本科甘蔗属植物，是最重要的糖科作物，同时也是乙醇、糖醛和葡聚糖的生产原料，甘蔗糖占我国食糖生产总量85％以上。甘蔗在生长过程中会受到多种病害尤其是病毒病的危害，经过长期无性繁殖留种，甘蔗品种和种质材料中会积累各种病毒，导致甘蔗品种退化、产量和糖分降低，给甘蔗产业造成重大的经济损失。世界范围内发现侵染甘蔗的病毒种类超过15种，包括DNA病毒类的甘蔗杆状病毒(Sugarcanebacilliformvirus，SCBV)和甘蔗线条病毒(Sugarcanestreakvirus，SSV)及RNA病毒类的甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus，SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus，SrMV)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcaneyellowleafvirus，ScYLV)、甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus，SCSMV)、玉米线条病毒(Maizestreakvirus，MSV)、玉米褪绿斑驳病毒(Maizechloroticmottlevirus，MCMV)、拉姆矮化病毒(Ramustuntvirus，RmSV)、甘蔗白条纹病毒(Sugarcanewhitestreakvirus，SWSV)、甘蔗斐济病毒(SugarcaneFijidiseasevirus，SFDV)、甘蔗矮缩病毒(Sugarcanedwarfvirus，SDV)、香蕉线条病毒(Bananastreakvirus，BSV)、甘蔗褪绿线条病毒(Sugarcanechloroticstreakvirus，SCSV)、甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestraitemosaicvirus，SSMV)等。其中，我国大陆地区报道的有SCMV、SrMV、ScYLV、SCSMV、SFDV、SCBV、SCSV、MCMV。近年，广西全区进行的病毒病害调查显示，广西甘蔗种植区目前主要受SrMV，SCMV，ScYLV、SCBV和SSV五种病毒侵染。不同甘蔗病毒引起的症状不同，引发的症状包括植株束顶矮化、叶片中脉变黄、叶部斑点和斑驳、叶片皱缩、茎秆节间出现裂缝等。基因检测是从核酸水平检测病毒，其检测的灵敏度和特异性均高于血清学检测，特别适用于准确性要求高的样本检测。目前甘蔗病毒的基因检测方法主要有PCR、RT-PCR、双链RNA(dsRNA)电泳和环介导等温扩增技术等，其中单重RT-PCR是目前应用最广泛的RNA病毒检测方法。但是单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两个以上的病毒，则需进行多次PCR，成本高且费时费力。目前甘蔗病毒基因检测方法中，尚无同时检测两种及两种以上病毒的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、简便、经济且准确的同时检测5种甘蔗病毒(含两种DNA病毒和三种RNA病毒)的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒，可同时检测DNA病毒和RNA病毒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH(其作用是对反应体系中的甘蔗总核酸的量进行评估)，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，还包括通用接头引物序列(UniversalTagSequence，UTS)的Tag-F序列和Tag-R序列，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.13至SEQ.ID.NO.14的碱基序列。含有上述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和引物组，引物组包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。阳性对照为含有SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV5种甘蔗病毒的甘蔗总核酸标准品，阴性对照为无病毒的甘蔗总核酸，引物组为预混的包含针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的反转录引物组(RTPrimerMix，RPM)，以及预混的针对上述病毒和内参基因的PCR引物组(ForwardPrimerMix)。上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，还包括以下试剂：10×MultiHotStartBuffer，SuperPuredNTPs，MgCl2，DNApolymerase，ddH20，dNTPMix，5×SuperRTBuffer，SuperRT，RNase-FreeWater。利用上述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法。反转录产物按以下方法制备：采用cDNA第一条链合成试剂盒，以提取的待测甘蔗样品的病毒核酸为模板，在20μL反应体系中加入所有反向引物的混合液RPM，使每条反向引物的终浓度为500nM，反转录制备cDNA模板；反转录体系为20μL，包括病毒核酸2μL，dNTPMix4μL，10×RPM2μL，5×SuperRTBuffer4μL，SuperRT1μL，RNase-FreeWater7μL；反应程序为PCR仪上42℃50min，85℃5min；反应结束立即插在冰上，-20℃保存备用。上述同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，PCR的反应体系和反应程序为：反应体系：共25μL，包括反转录产物8μL，ForwardPrimerMix2μL，10×MultiHotStartBuffer2.5μL，SuperPuredNTPs2μL，MgCl22μL，DNApolymerase0.5μL，ddH2O6μL；其中ForwardPrimerMix为所有正向引物和接头引物按1∶60比例组成的混合液，每条正向引物的终浓度为200nM；反应程序：95℃预变性15min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。针对上述五种常见甘蔗病毒缺乏快速有效同时检测手段的问题，专利技术人根据其核苷酸保守区序列设计并合成了同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV5种甘蔗病毒(引物所在病毒的保守区域见图1～图5)和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。据此，专利技术人还对影响多重RT-PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立了相应多重RT-PCR检测方法，该法在一个单一反应体系中加入5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时检测5种甘蔗病毒的多重RT‑PCR检测引物组，其特征在于包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。2.根据权利要求1所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于还包括通用接头引物序列的Tag-F序列和Tag-序R列，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.13至SEQ.ID.NO.14的碱基序列。3.含有权利要求1或2所述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和引物组。5.根据权利要求4所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒的甘蔗总核酸标准品，阴性对照为无病毒甘蔗总核酸，引物组为预混的包含针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的反转录引物组(RTPrimerMix，RPM)，以及预混的针对上述病毒和内参基因的PCR引物组(ForwardPrimerMix)，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.14的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈保善，邹承武，郭枫，姚姿婷，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45