一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用植物微组织直接RT‑PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：(1)模板RNA提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位(茎、叶柄或根)，并停留2‑3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果；本发明专利技术方法不需要单独步骤来分离提取待检测样品的RNA，能在较短的时间内制备用于PCR反应的RNA模板，方便快捷，且不需要仪器设备；广谱性高，可检测多种植物病毒，大大提高植物病毒检测的效率和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法
本专利技术涉及植物病毒检测
，尤其涉及一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法。
技术介绍
为了防止植物病毒在国家和地区之间的移动，控制植物病毒性疾病，植物病毒检测在检疫检查中是必要的。长期以来，人们一直致力于开发简单有效的植物病毒检测方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Jamesetal.,2006)、real-timeRT-PCR(Mirmajlessetal.,2015)和逆转录环介导等温扩增(RT-loop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP，Luetal.,2018)，微阵列(Liuetal.,2017)和下一代测序(Jonesetal.,2017)。其中，由于其灵敏度高且操作较简便，RT-PCR的方法已广泛应用于病毒检测(Jamesetal.,2006；Janetal.,2011)。现有的RT-PCR检测植物病毒的过程中，RNA模板的制备需要RNA的分离和纯化。RNA的分离是一项技术性强、耗时长的工作，需要一定量的植物材料和离心步骤。RNA提取后，必须对RNA提取液进行纯化，以获得高质量的RNA。在这些步骤中，操作人员的技术错误可能导致RNA污染或降解，从而导致错误的检测结果(Jamesetal.,2006；Janetal.,2011)。即目前的RT-PCR检测植物病毒存在模板RNA制备较困难、检测速度较慢、检测效率较低、准确度较差、成本高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：(1)模板RNA的制备和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留2-3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果。本申请的专利技术人通过大量实验发现，采用无菌注射器针取样所粘附的植物汁液中含有微量植物病毒RNA，这些植物病毒RNA在RT反应液即逆转录反应液中被逆转录酶通过随机引物逆转录为cDNA(这时的cDNA有植物病毒的，也有植物组织的)，然后在PCR反应液中加入针对待检测植物病毒靶基因序列的引物，在该对引物的引导下，DNA聚合酶只扩增植物病毒RNA靶基因序列，从而可以排除样品中其他DNA和蛋白等的干扰，即可以免去RNA样本的分离提取步骤，也能消除DNA等对于RT-PCR的影响，从而大大提高检测效率和准确性。本申请的方法，又称为植物微组织直接逆转录聚合酶链反应(microtissuedirectreversetranscription-polymerasechainreaction)，即MDRT-PCR法。作为优选的技术方案：步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为含有葡萄卷叶病毒3(即GLRaV-3)或苹果茎沟病毒(即ASGV)或马铃薯卷叶病毒(即PLRV)或黄瓜花叶病毒(即CMV)其中一种的样品。作为优选的技术方案：步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。即植物的茎、叶柄和根均可作为本方法合适的取样检测器官。作为优选的技术方案：步骤(1)所述无菌注射器针大小为26G、25G或23G。作为进一步优选的技术方案：步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为26G。实验显示，用25G和23G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度分别为50％和25％,而用26G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度最高，为100％作为优选的技术方案：步骤(1)所述逆转录混合物包含5μL5XTRUERTMasterMix和20μLRNase-freeddH20。作为优选的技术方案：步骤(1)所述在逆转录混合物中进行反应的调节为室温中反应15分钟。作为优选的技术方案：步骤(2)所述PCR反应方法为：在25μLPCR管配制反应体系，0.5μM引物混合液2μL，2xTaqDNApolymeraseMix12.5μL，模板cDNA2μL，RNase-freeddH20补齐到25μL。作为进一步优选的技术方案：步骤(2)中：葡萄卷叶病毒3检测的PCR反应程序:94℃保持30s,52℃保持30s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持7min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；苹果茎沟病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,54℃保持45s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；马铃薯卷叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,50℃保持30s，72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持10min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；黄瓜花叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持15s,54℃保持30s,72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环30次，然后在4℃冷藏。作为优选的技术方案：步骤(3)中，所述电泳分析为2％琼脂糖凝胶电泳分析。与目前现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术方法不需要对待检测样品的RNA进行分离提取，能在较短的时间内制备用于PCR反应的RNA模板，节约了时间(至少2个小时)和成本(分离提取RNA的试剂和耗材费用)，操作方便快捷；广谱性高，适用于多种植物病毒检测，大大提高植物病毒检测的效率和准确性。附图说明图1为采用3种不同规格的无菌注射器针(26G、25G和23G)对葡萄“赤霞珠”试管苗取样后采用本专利技术的MDRT-PCR法进行检测的电泳图；图2为分别对葡萄“赤霞珠”试管苗的茎、叶柄和根进行取样后采用本专利技术的MDRT-PCR法进行检测的电泳图；图3为分别采用本专利技术的MDRT-PCR法与传统的RT-PCR法对葡萄“赤霞珠”试管苗中的GLRaV-3进行检测的电泳图；图4为分别采用本专利技术的MDRT-PCR法与传统的RT-PCR法对苹果“Gala”试管苗中的ASGV进行检测的电泳图。图5为分别采用本专利技术的MDRT-PCR法与传统的RT-PCR法对马铃薯“紫花白”试管苗中的PLRV进行检测的电泳图；图6为分别采用本专利技术的MDRT-PCR法与传统的RT-PCR法对东方百合“西伯利亚”试管苗中的CMV进行检测的电泳图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作进一步说明。实施例1：MicrotissuedirectRT-PCR反应体系的准备：(1)RT反应液：TRUERTMasterMix(北京艾德莱生物科技有限公司)；(2)PCR反应液：TaqDNApolymeraseMix(北京艾德莱生物科技有限公司)；(3)四个植物病毒检测时PCR反应的引物对分别为：(4)电泳液：Tris-acetate(TAE)buffer(40mMTris-acetate,1mMEDTA,pH8.0)。用上述反应体系按以下方法对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用植物微组织直接RT‑PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)模板RNA的提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留2‑3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)模板RNA的提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留2-3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果。2.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为感染葡萄卷叶病毒3即GLRav-3、苹果茎沟病毒即ASGV、马铃薯卷叶病毒即PLRV或黄瓜花叶病毒即CMV其中一种的样品。3.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。4.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述无菌注射器针大小为26G、25G或23G。5.根据权利要求4所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为26G。6.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述逆转录混合物包含5μL5XTRUERTMasterMix和20μLRNase-freeddH20。7.根据权利要求1所述的采...

【专利技术属性】
技术研发人员：李姣，
申请(专利权)人：四川师范大学，
类型：发明
国别省市：四川,51