本发明专利技术涉及一种柠檬苦素类化合物的分离富集方法，其特征在于，狭叶白鲜皮粉碎物，用乙醇溶液加热回流提取3～4次，过滤，合并滤液，浓缩后分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，选择二氯甲烷萃取部位，结合硅胶柱色谱、Sephadex LH‑20、制备型HPLC、重结晶等分离纯化手段，分离柠檬苦素类化合物。该方法分离效率高、污染小、成本较低，具有较强的推广与应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种从狭叶白鲜皮中分离柠檬苦素类化合物的方法
：本专利技术属于天然产物分离领域，尤其是涉及一种从狭叶白鲜皮中分离柠檬苦素类化合物的方法。
技术介绍
：狭叶白鲜皮，又名新疆白鲜皮，属于芸香科白鲜属的多年生草本植物，是我国特有的中药药材，在新疆当地多用作中药白鲜的替代品，其味苦，性寒。具有清热解毒、祛风除湿、杀虫止痒等作用。根皮入药后，可用于治疗风湿，出血，瘙痒，黄疸，慢性肝炎，皮肤病等疾病。实际上狭叶白鲜皮主要含有两类有效成分：呋喃喹啉类生物碱和柠檬苦素类化合物。其中柠檬苦素类化合物活性丰富，药理研究表明其具有抗癌抗肿瘤、抗炎、免疫调节、血管舒张活性、防虫等作用。柠檬苦素作为一种常见的萜类化合物，广泛存在于芸香科植物中，其中在柑橘属中较为常见。目前，国内外对柠檬苦素类化合物的各方面研究较多，而对从狭叶白鲜皮中提取柠檬苦素类化合物的方法报道较少，且方法比较传统，使用溶剂量大污染严重，效率低。本专利技术方法通过薄层色谱板(TLC)对二氯甲烷萃取部位进行检测，结合1％香草醛-浓硫酸显色，发现该部位存在多种柠檬苦素类成分，对该部位的分离能够有效的节约成本，更高效的得到柠檬苦素类化合物。
技术实现思路
：本专利技术提供了一种结合现有技术从狭叶白鲜皮中分离柠檬苦素类化合物的方法，解决了传统方法成本较高，污染严重，操作繁琐，效率低下，纯化困难等缺点。本专利技术所提供的柠檬苦素类化合物可分为柠檬苦素苷元类和降解型柠檬苦素。本专利技术目的在于高效率的从狭叶白鲜皮中分离富集呋喃喹啉类生物碱，该方法主要包括以下几个步骤：1.提取：取10kg狭叶白鲜皮粉碎物，加入25L85％的乙醇溶液，常温浸泡6h后，加热回流提取4h，过滤，收集滤液，滤渣中加入25L85％乙醇溶液，加热回流提取3h，重复上述操作，共加热回流提取3次，加热时长分别为4h，3h，3h。合并三次滤液，浓缩成干燥浸膏565g。2.萃取：上述浸膏加入1L温水形成混悬液，静置降温后，依次使用等体积1L的石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯萃取三次，回收萃取液，浓缩成各部位萃取浸膏，得二氯甲烷部位浸膏77g。3.分离纯化：二氯甲烷部位，使用二氯甲烷/甲醇混合溶剂溶解，1.5倍量的100-200目硅胶拌样，10倍量的200-300目的硅胶装柱，以二氯甲烷/甲醇系统进行梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇比例为1∶0～0∶1，以500ml为一流分，共得到35个流分，合并相同流分，得到9个流分，分别为DAC-1～DAC-9。通过薄层色谱板点板，结合1％香草醛-浓硫酸显色剂，选取DAC-3，DAC-8这两个柠檬苦素比较集中的流分进一步分离纯化。DAC-3流分使用硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的比例为50∶1～1∶1，以100ml为一流分，得到63个流分，合并相同流分，得6个流分，分别为3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6，洗脱期间，得到白色粉末状固体与块状结晶固体，经重结晶纯化后，得到化合物1和化合物2。3.4流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸有紫红色斑点显色，通过硅胶柱色谱，石油醚/丙酮(20∶1)系统洗脱，得到两个显色成分，经制备薄层色谱，得到化合物2和3。3.5流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现多个紫色显色点以及一个墨绿色显色点，其中两个点经薄层色谱板对比验证为化合物1和2，通过硅胶柱色谱，石油醚/丙酮(20∶1)系统洗脱，制备HPLC分离纯化后，分别获得化合物4和5。3.6流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现紫红色显色点，使用硅胶柱色谱，石油醚/丙酮(15∶1)系统洗脱，经制备型HPLC分离纯化后，得到化合物6。DAC-8经反复硅胶柱色谱，二氯甲烷/乙酸乙酯系统梯度洗脱，二氯甲烷/乙酸乙酯的比例为50∶1～1∶1，以100ml为一流分，得到78个流分，合并相同流分，得6个流分，分别为8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6。其中8.1和8.6流分通过薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现无显色点，舍去。8.2流分通过薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现存在多个紫色显色点，经过硅胶柱色谱，石油醚/丙酮(3∶1)洗脱，得到化合物7。该流分进一步通过石油醚/丙酮(3∶1)系统洗脱，通过制备薄层色谱分离纯化，得到化合物8和9。8.3流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现多个显色成分点，其中一个经对比为化合物8，经过硅胶柱色谱，二氯甲烷/丙酮(10∶1)洗脱，得到混合物白色粉末，通过制备型HPLC分离，重结晶纯化，得化合物10和11。剩余部分经点板，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现还存在两个明显的紫色显色点，经制备薄层色法，得到化合物12和13。8.4流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现两个显色点，经对比为化合物10和12，合并。8.5流分经薄层色谱板检测，1％香草醛-浓硫酸喷洒，加热显色后，发现两个紫色显色点，通过硅胶柱色谱，二氯甲烷/丙酮(5∶1)系统洗脱，凝胶柱纯化后，得到化合物14。经过硅胶柱色谱，SephadexLH-20，制备型HPLC，重结晶等手段，从二氯甲烷萃取部位分离得到14个柠檬苦素类化合物。4.结构解析：通过对化合物的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱的解析，以及和有关文章报道的数据进行比较，确定化合物结构。化合物1～14的结构鉴定：化合物1(柠檬苦素)：白色无定形粉末(二氯甲烷+甲醇)，易溶于二氯甲烷，丙酮，乙酸乙酯，难溶于甲醇。254nm紫外灯下有暗斑，365nm无荧光，碘熏显棕黄色，1％浓硫酸-香草醛喷洒加热显紫红色。ESI-MSm/z471[M+H]+，分子量为470。核磁共振氢谱数据见表1，并与文献(董丽荣等，2010)报道数据相比较，鉴定结构为柠檬苦素(Limonin)。化合物结构见附图2。表1化合物1的核磁共振(1H)数据(300MHz，溶剂CDCl3)δH为H的化学位移。化合物2(黄柏酮)：白色无定形粉末，254nm紫外灯下无暗斑，365nm紫外灯下无荧光，碘显黄色，1％浓硫酸-香草醛喷雾加热显酒红色。ESI-MSm/z455[M+H]+，分子量为454，结合1HNMR谱，可确定其分子式为C26H30O7，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据见表2，并与文献报道数据(RuguttJK等，1996)相比较，鉴定结构为黄柏酮(Obacunone)。化合物结构见附图3。表2化合物2的核磁共振(1H)数据(300MHz，溶剂CDCl3)化合物3(DictangustoneD)：红褐色油状物，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，不溶于石油醚；254nm紫外灯下有暗斑，碘熏显黄色，1％香草醛-浓硫酸喷洒显鲜绿色。HR-ESI-MS，m/z：437.1925[M+Na]+(calcd.for[C24H30NaO6]+，437.1935)，分子式为C24H30O6，不饱和度Ω＝10。核磁共振氢谱和碳谱数据见表3，并与文献(孙建博，2014)报道数据相比较，鉴定结构为Isomaculosidine。化合物结构见附图4。表3化合物3的核磁共振(1H、13C)数据(300MHz，溶剂CDCl3)化合物4(Obacun本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从狭叶白鲜皮中分离柠檬苦素类化合物的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)提取：狭叶白鲜皮粉碎物10kg，加入乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，依次使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到各萃取部位浓缩浸膏。(3)分离：各萃取部位浸膏，经薄层色谱板检测，改良碘化铋钾显色后，选取二氯甲烷部位进行分离纯化，通过硅胶柱色谱，使用二氯甲烷/甲醇系统进行梯度洗脱，以500ml为一流分，共得到35个流分，合并相同流分，得到9个流分，分别为DAC‑1～DAC‑9。通过薄层色谱板检测，结合1％香草醛‑浓硫酸显色剂显色，选取DAC‑3，DAC‑8这两个生物碱比较集中的流分进一步分离纯化。DAC‑3流分，经硅胶柱色谱，石油醚/丙酮和二氯甲烷/丙酮系统洗脱，结合Sephadex LH‑20、制备型HPLC、重结晶手段纯化，得到化合物1～6。DAC‑8流分，经硅胶柱色谱，石油醚/丙酮和二氯甲烷/丙酮系统洗脱，结合Sephadex LH‑20、制备型HPLC、重结晶手段纯化，得到化合物7～14。(4)结构鉴定：化合物1～14分别鉴为柠檬苦素(Limonin)、黄柏酮(Obacunone)、Dictangustone D、Obacunoic acid、Dictangustone F、Dictangustone E、梣酮(fraxinellone)、Isodictamdiol、Dictangustone C、Dictangustone A、Dictangustone B、诺米林(nomilin)、Dictamdiol A、Isoobacunoic acid。...
【技术特征摘要】
1.一种从狭叶白鲜皮中分离柠檬苦素类化合物的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)提取：狭叶白鲜皮粉碎物10kg，加入乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，依次使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到各萃取部位浓缩浸膏。(3)分离：各萃取部位浸膏，经薄层色谱板检测，改良碘化铋钾显色后，选取二氯甲烷部位进行分离纯化，通过硅胶柱色谱，使用二氯甲烷/甲醇系统进行梯度洗脱，以500ml为一流分，共得到35个流分，合并相同流分，得到9个流分，分别为DAC-1～DAC-9。通过薄层色谱板检测，结合1％香草醛-浓硫酸显色剂显色，选取DAC-3，DAC-8这两个生物碱比较集中的流分进一步分离纯化。DAC-3流分，经硅胶柱色谱，石油醚/丙酮和二氯甲烷/丙酮系统洗脱，结合SephadexLH-20、制备型HPLC、重结晶手段纯化，得到化合物1～6。DAC-8流分，经硅胶柱色谱，石...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙建博，王莹，李强强，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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