一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗及其制备方法。本发明专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成，采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖与载体蛋白白喉类毒素结合，增强了疫苗免疫效力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。本发明专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本，具有良好的应用前景。

A Pasteurella multocida capsular polysaccharide protein conjugate vaccine and its preparation method

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to an avian Pasteurella capsular polysaccharide protein binding vaccine and a preparation method thereof. The capsular polysaccharide-protein binding vaccine of Pasteurella avium provided by the invention is composed of Pasteurella avium capsular polysaccharide and diphtheria toxin carrier protein through nano-microspheres. The capsular polysaccharide of Pasteurella multocida is combined with carrier protein diphtheria toxin to enhance the immune efficacy of the vaccine, and to homologous strains and heterologous strains. The infection of the strain played a role of cross protection. The preparation method of the avian Pasteurella capsular polysaccharide protein binding vaccine provided by the invention has simple operation, cost saving and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌简称巴氏杆菌，是一种有荚膜的革兰氏阴性短杆菌，能够感染家畜、家禽和野禽等多种动物。临床研究表明，禽霍乱是主要由血清型A∶1、A∶3或A∶4巴氏杆菌引起的一种接触性传染病，对养禽业造成严重的经济损失。中国专利申请CN105288607A公开了一种禽巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，该方法制备的禽巴氏杆菌病灭活疫苗免疫家兔，起到了良好的免疫家兔的作用，但是，在使用过程中，这种灭活疫苗在体内的作用时间较短，需要多次接种，使用费时费力。中国专利CN102139116B公开了一种禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法，该方法制备的疫苗通过引入真核载体，具有高效高速转染的能力，增强免疫活性。但是该制备方法操作复杂，需要严密的操作流程，制备成本较高。荚膜多糖是主要的毒力因子，是细菌在一定环境中产生的胶态或粘液性的物质，该物质大都是多糖、多肽或多糖蛋白复合体等，在细胞壁外积累形成稳定的、较厚的致密保护层。20世纪90年代大量学者研究发现多杀性巴氏杆菌可分为A，B，D，E和F五种荚膜血清群。研究发现含有荚膜的多杀性巴氏杆菌分离株比无荚膜的相关变异菌株毒力更强，证明荚膜对多杀性巴氏杆菌的致病性起着重要的作用。研究表明A型无荚膜突变株对试验鸡无致病性，且该突变株不能在鸡肌肉细胞上增殖，然而高剂量的该无荚膜的突变菌株作疫苗却能刺激试验鸡产生相关的免疫性保护。表明荚膜是合理有效的巴氏杆菌候选亚单位疫苗。目前，用灭活疫苗和活菌疫苗来预防禽霍乱，但灭活疫苗只对同源菌株的感染具有保护作用，而活菌疫苗对同源菌株和异源菌株的感染具有一定的交叉保护作用，因此具有广泛的应用前景。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术的目的是提供一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法。本专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖，并采用减毒活菌疫苗来预防禽霍乱，增强了疫苗毒力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。本专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本。本专利技术的技术方案如下:本专利技术提供了一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。进一步地，所述纳米微球由生物高分子材料制备而成。进一步地，所述生物高分子材料为壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、海藻酸钠中的一种或几种。进一步地，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的重量比为6-25:7-30：10。进一步地，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖从巴氏杆菌中提取得到。本专利技术还提供了一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1、称取重量为荚膜多糖1.2-1.5倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3-5倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为0.1-5mg/mL的混合液；S2、将步骤S1制得的混合液在压力为20-50MPa条件下乳化5-8次，每次2-3min，然后以1000-3000转/分钟速度搅拌10-30min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为8000-12000r/min，得到直径为50-150nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.2-1.5的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后进行醛基化反应得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；S6、用质量分数为0.3％-0.4％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。进一步地，所述步骤S5中醛基化反应具体操作为：在磷酸缓冲液中，温度为30-37℃，pH＝5-7的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体。进一步地，本专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)本专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖，并采用减毒活菌疫苗来预防禽霍乱，增强了疫苗毒力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。(2)本专利技术提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细、完整地说明。以下所用试剂或设备均为市售品种，如无特殊说明，均按照说明书操作，在此不做赘述。实施例1、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为15:18:25。制备方法如下：S1、称取重量为荚膜多糖1.2倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为1％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为0.1mg/mL的混合液；S2、将步骤S1制得的混合液在压力为20MPa条件下乳化5次，每次2min，然后以1000转/分钟速度搅拌30min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为8000r/min，得到直径为150nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.2的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后在磷酸缓冲液中，温度为30℃，pH＝5的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；S6、用质量分数为0.3％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。实施例2、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为10:15:4。制备方法如下：S1、称取重量为荚膜多糖1.5倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3-5倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为10％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为5mg/mL的混合液；S2、将步骤S1制得的混合液在压力为50MPa条件下乳化8次，每次3min，然后以3000转/分钟速度搅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗，其特征在于，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。2.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述纳米微球由生物高分子材料制备而成。3.如权利要求2所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：所述生物高分子材料为壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、海藻酸钠中的一种或几种。4.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的重量比为6-25:7-30：10。5.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖从巴氏杆菌中提取得到。6.如权利要求2所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、称取重量为荚膜多糖1.2-1.5倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3-5倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为0.1-5mg/mL的混合液；S2、将步骤S1制得的混合液在压力为20-50MPa...

【专利技术属性】
技术研发人员：严悌昆，张毓金，谢秉超，杨球，马军，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44