本发明专利技术涉及对细胞间粘附分子‑1(ICAM‑1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，其包含人淋巴细胞功能相关抗原1(LFA‑1)的αL亚基的I结构域。本发明专利技术特别涉及包含人I结构域的CAR，所述人I结构域对ICAM‑1具有不同的亲和力(1mM至1nM Kd)。包含对ICAM‑1具有低亲和力(1‑200μM Kd)的人I结构域的CAR T细胞可以避免靶向具有基础ICAM‑1表达的健康组织，同时表现出增加的对具有高ICAM‑1表达的肿瘤组织的效能和长期效力。本发明专利技术也涉及用于治疗癌症的过继性细胞治疗方法，所述方法包括将包含人I结构域的CAR‑T细胞施用给遭受癌症的受试者，其中所述CAR T细胞结合过表达ICAM‑1的癌细胞并杀死所述癌细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对ICAM-1特异性的I结构域嵌合抗原受体对序列表、表或计算机程序的引用在此与说明书一起并行地经由EFS-Web呈送作为ASCII格式文本文件的序列表，其具有序列表.txt的文件名称，具有2017年7月17日的创建日期和9.89千字节的大小。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的部分，且特此通过引用以其整体并入本文中。
本专利技术涉及包含人I结构域的对ICAM-1特异性的嵌合抗原受体。本专利技术具体地涉及对ICAM-1具有不同亲和力(1mM至1nM)的包含人I结构域的嵌合抗原受体。
技术介绍
免疫疗法作为一种非常有前途的用于治疗癌症的方案出现。用CAR遗传修饰T细胞是一种常见的设计肿瘤特异性T细胞的方案。可以将靶向肿瘤相关抗原的CAR(嵌合抗原受体)-T细胞输入患者(过继性细胞转移或ACT)中，从而代表一种有效的免疫疗法方案。CAR-T技术相对于化学疗法或抗体的优点是，重新程序化的经工程改造的T细胞可以在患者中繁殖和持续，并象活药物一样工作。CAR分子由合成的结合部分组成，所述结合部分通常是抗体衍生的单链可变区片段(svFv)或任何天然抗原感知元件，其与由TCRζ链和共刺激分子(诸如CD28和/或4-1BB)组成的细胞内信号传递结构域融合1,2。CAR介导的靶向的优点包括：1)与天然的非整合的TCR和共刺激信号传递相比，经由单个结合事件提供顺式(in-cis)活化、增殖和存活信号；2)通过独立于MHC的抗原识别绕过肿瘤细胞对MHC的下调的能力；和3)减小的活化阈值以及由CAR和抗原之间的高亲和力相互作用实现的对具有低抗原密度的肿瘤细胞的识别3,4。理想的CAR靶抗原将是天然的表面暴露的肿瘤新抗原，其被高度表达且在健康的组织中不可检测到。但是，由于这样的抗原的绝对稀少，许多通常被靶向的实体瘤抗原也由非肿瘤组织表达，尽管在较低的水平。对这样的抗原具有高亲和力的CAR分子可以导致健康组织的并行靶向，从而导致靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性，即迄今为止CART细胞疗法的进展的一个主要限制因素。使用单链抗体形式构建常规CAR，并选择性地工程改造成对靶抗原具有亚-至低纳摩尔亲和力。但是，仅当靶向真实肿瘤抗原或具有最高限制水平的那些时，增加的CART细胞敏感性可以是一个优点17,36。否则，增加的敏感性以降低的选择性为代价，以对抗原密度在很大程度上不敏感的方式裂解表达靶标的细胞18。需要具有改善的治疗指数的CAR，即，可以杀死肿瘤并同时使全身毒性最小化的CAR。附图说明图1A-1G显示了在亲和力方面具有逐步106倍变化的ICAM-1特异性的CAR的构建和它们的体外结果。图1A:与ICAM-1形成复合物的LFA-1的示意图。将LFA-1整联蛋白的α和β链和模块结构域标记。将LFA-1和ICAM-1相互作用必需的金属离子显示在圆圈中。图1B:以条带简图描绘了LFA-1I结构域和ICAM-1(D1)的N-端结构域的结构模型。指示了N和C-端和突变热点。图1C:与固定化的人ICAM-1结合的I结构域变体的SPR感应图，除了F265S/F292G*以外，其在鼠ICAM-1上面流动(取自Jin等人的图254,和Wong等人的图155)。图1D:编码I结构域CAR的慢病毒载体的示意图.LTR＝长末端重复序列；SD＝剪接供体；SA＝剪接受体；ψ+＝包装信号；SS＝信号序列；TM＝跨膜；Cyt＝细胞溶质结构域。图1E:与用Myc-标记的CAR(TM、F292G、F292A和WTI结构域)转导的JurkatT细胞结合的抗-Myc抗体。NT＝未转导。图1F:与在HEK293T细胞中表达的CAR结合的重组ICAM-1-Fc。图1G:测量在JurkatT细胞中表达的I结构域CAR与可溶性人(顶)和鼠(底)ICAM-1(CD54)包被的表面之间的相对结合亲合力的V-底粘附测定。n＝3；对于*，相对于NT而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。图2A-2D显示了体外原代CART细胞的亲和力和抗原密度依赖性活化.图2A:用于测量用不同的I结构域CAR转导的原代T细胞的靶标杀死的效应物:靶标(E:T)测定。将每种靶标分别与TM、F292G、F292A或WTCART细胞一起以5:1E:T比率温育。将生存力百分比归一化至来自与NTT细胞一起温育的靶细胞的发光(n＝3,±＝标准差(SD))。使用可变斜率S形曲线方程式拟合数据。对于*，相对于NT而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。图2B:将50％杀死的最佳拟合值和S形方程式的Hill斜率相对于I结构域CAR的亲和力绘图。绘制了具有高于0.85的r-平方值的最佳拟合值。图2C:与HeLa细胞相比在原代T细胞中的ICAM-1表达。灰色和黑色直方图分别对应于未标记的细胞和R6.5抗体标记的细胞。图2D:在与不同的靶细胞一起共温育24h以后，为每种CART变体通过ELISA测量IFN-γ释放(n＝3)。对于*，相对于8505C/-ICAM-1而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。图3A-3C表明微摩尔亲和力CART细胞会提供优良的肿瘤根除、肿瘤复发抑制和存活益处.图3A:使用全身发光成像来估计肿瘤植入后8天输入不同的CART细胞变体的小鼠中的肿瘤负荷。无T＝小鼠不接受T细胞。图3B:肿瘤植入后10天用CART细胞治疗的小鼠。NT＝未转导的T细胞。图3C:接受不同治疗的小鼠的存活曲线。对于无T和TM，相对于NT的Log-rank(Mantel-Cox)检验P值是非显著的，且对于F292G而言p＝0.008，对于R6.5而言p＝0.025，和对于F292A而言p＝0.0016。图4A-4D显示了肿瘤负荷、T细胞分布和细胞因子释放的纵向并行测量。图4A:SSTR2-I结构域载体的示意图。图4B:通过PET/CT对NOTAOCT摄取(每个小图的上半)和通过全身发光成像对肿瘤负荷(每个小图的下半)的纵向测量。图像是每个组群中的四只小鼠的代表。在最大示踪剂摄取当天拍摄的全身PET/CT图像显示在最右侧。在底小图下面指示了成像时间点。例如，15代表肿瘤异种移植以后15天(和T细胞输注以后7天)。图4C:如指示治疗的小鼠的肺中的发光和示踪剂摄取的定量。顶小图:NT(未转导的)T细胞。底水平:CAR-F292A。图4D:描绘了在不同时间点从‘b’和‘c’中的相同小鼠抽取的血液所测得的细胞因子水平(平均值±SD，一式两份测量)。顶小图:NT(未转导的)T细胞。底水平:CAR-F292A。具体实施方式定义本文中使用的“约”表示列举的值±10％。本文中使用的“过继性T细胞疗法”包括肿瘤特异性的T细胞的分离和离体繁殖以达到比通过单独疫苗接种得到的结果更大数目的T细胞。然后将肿瘤特异性的T细胞输入具有癌症的患者中，以尝试给他们的免疫系统赋予通过T细胞(其可以攻击和杀死癌症)挫败剩余肿瘤的能力。本文中使用的“亲和力”是单个分子(例如，I结构域)与其配体(例如，ICAM-1)的结合的强度。通常通过平衡解离常数(KD或Kd)测量和报道亲和力，所述平衡解离常数用于评价双分子相互作用的强度等级并排序。本文中使用的“嵌合抗原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其从N‑端至C‑端包含：(i)人淋巴细胞功能相关抗原‑1的αL亚基的I结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激性结构域，和(iv)活化结构域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.02 US 62/383,139;2016.11.09 US 62/419,8171.一种嵌合抗原受体(CAR)，其从N-端至C-端包含：(i)人淋巴细胞功能相关抗原-1的αL亚基的I结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激性结构域，和(iv)活化结构域。2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述I结构域是野生型I结构域或其具有1-3个氨基酸突变的突变体。3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述I结构域以约1mM至约1nM的亲和力结合ICAM-1。4.根据权利要求2所述的CAR，其中所述野生型I结构域包含SEQIDNO:1的130-310个氨基酸的序列。5.根据权利要求4所述的CAR，其中所述突变体具有在野生型I结构域的氨基酸残基265、288、289、292、295或309处的一个或多个突变，或其具有至少95％同一性的序列，其中所述氨基酸残基的编号对应于SEQIDNO:1的氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：金文殊，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：美国,US
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