检测CYP2C8点突变的引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种CYP2C8*2和CYP2C8*3分型的特异性引物和方法，其包括扩增CYP2C8*2多态性位点的1对引物；扩增CYP2C8*3多态性位点的2对引物。利用PCR扩增技术和Sanger测序技术，本发明专利技术可快速地将CYP2C8分型相关的位点检测出来。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，可为临床药理学家进行临床个体化给药、以及新药候选化合物的结构优化和进一步筛选提供有用信息。

Primers and methods for detecting CYP2C8 point mutations

The present invention discloses a specific primer and method for CYP2C8*2 and CYP2C8*3 typing, comprising one pair of primers for amplifying CYP2C8*2 polymorphic loci and two pairs of primers for amplifying CYP2C8*3 polymorphic loci. By using PCR amplification technology and Sanger sequencing technology, the invention can quickly detect the sites related to CYP2C8 typing. The test results obtained by the invention are accurate, and can provide useful information for clinical pharmacologists to carry out clinical individualized administration, as well as structural optimization and further screening of new drug candidate compounds.

【技术实现步骤摘要】
检测CYP2C8点突变的引物和方法
本专利技术属于医学及生物
，一种使用PCR及Sanger测序法检测CYP2C8点突变的方法和引物。技术背景细胞色素超级家族是一大类血红素蛋白，广泛地存在于各种生命体中，在氧化代谢众多的生命体外源性化学物质方面发挥重要作用。不同的个体对于药物以及其他毒性物质会出现不同的反应，很多这种差异性已被证实是由于人体细胞色素P450的基因多态性引起的。另外，负责代谢生命体内源性物质的细胞色素P450的基因多态性形也是某些特定遗传疾病的致病原因。CYP2C8在人体肝脏微粒体细胞色素中约占7％，至少负责代谢5％的临床药物。多种重要的药物都可作为CYP2C8的底物，包括抗癌药物、抗心律不齐药物、降血糖药物、抗癫痫药物、HMG-CoA还原酶抑制药物等。CYP2C8基因多态性的研究对于实现用药个体化能发挥重要的作用。另外，一些由CYP2C8基因多态性导致的特定疾病也已见报道。到目前为止，已有10多种CYP2C8的基因多态性被报道，其中发生频率较高为突变体CYP2C8*2(I269F)和突变体CYP2C8*3(R139K和K399R)。CYP2C8*2的突变发生在5号外显子上，第269位氨基酸由异亮氨酸突变为苯丙氨酸。其发生频率具有明显的种族差异性，在非洲人中的突变频率为15％-20％，在欧洲、亚洲人中鲜有或未发现该突变体。CYP2C8*3的突变是两个SNP的紧密连锁，分别发生在3号和8号外显子上，第139位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸，第399位赖氨酸突变为精氨酸。CYP2C8*3是最常见的CYP2C8的基因多态性之一，主要存在于白人中(等位基因频率为10％-23％)，在非洲和亚洲人群中较为少见。携带CYP2C8*3纯合突变(A/A)和杂合突变(G/A)基因型患者对紫杉醇的清除活性大大降低，约为野生型患者的15％，这可能引起药物在体内更多的积累，因此CYP2C8*3带有A的患者应适当减少用药量。CYP2C8的紫杉醇6ɑ羟基化活性的个体间差异可达38倍，导致紫杉醇的临床治疗效果和药物安全性参差不齐。因此，对于CYP2C8基因分型的研究具有十分重要的学术意义和临床意义。鉴于CYP2C8基因在患者中的特点，其基因分型情况可能为患者用药指导提供重要的分析依据，通过分析CYP2C8基因相关突变进行预后评估是具有前景的技术研究方向。因此，如何快速全面的获得检测对象基因分型的数据，成为当前亟需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供CYP2C8基因分型的引物和方法，综合应用PCR扩增和基因测序技术，可用于快速检测检测CYP2C8*2和CYP2C8*3两种常见基因型。所述检测CYP2C8基因多态性的引物，包括：扩增CYP2C8基因的引物，其碱基序列为：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：检测CYP2C8基因的测序引物碱基序列为：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’进一步地，引物序列CYP2C8-1F/CYP2C8-1R是扩增CYP2C8*2I269位点的引物，引物序列CYP2C8-2F/CYP2C8-2R和CYP2C8-3F/CYP2C8-3R是扩增CYP2C8*3R139位点和K399位点的引物。本专利技术还提供了检测CYP2C8基因多态性的方法，包括以下步骤：1.抽提外周血中的基因组DNA；2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；3.对步骤2中的扩增产物进行测序；4.对测序结果进行判断，确定CYP2C8基因是否发生突变；其中PCR扩增引物为：扩增CYP2C8基因的引物，其碱基序列为：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：检测CYP2C8基因的测序引物碱基序列为：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’有益效果：本专利技术设计了扩增CYP2C8*2和CYP2C8*3分型多态性位点的特异性引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本专利技术所述引物能将所述CYP2C8*2和CYP2C8*3多态性位点都扩增出来，保证无论这些多态性位点的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。检测过程快速灵敏，操作简单且准确性高，检测结果明确清晰；检测特异性强，采用目前最准确的基因突变检测方法，目的性强；检测标本采血量少，使用的实验器材较少，节约成本。附图说明图1是使用本专利技术引物测序方法对第一例待检血液样本进行筛查CYP2C8*2的I269位点测序图。(框选中位置为I269位点)。图2是使用本专利技术引物测序方法对第二例待检血液样本进行筛查CYP2C8*3的R139位点测序图。(框选中位置为R139位点)。图3是使用本专利技术引物测序方法对第三例待检血液样本进行筛查CYP2C8*3的K399位点测序图。(框选中位置为K399位点)。具体实施方式实施例1抽提血液中的DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以DNA为模板使用Sanger测序法检测CYP2C8基因多态性位点的引物，其特征在于，包括有：CYP2C8‑1F 5’‑TTCAATCAGGGCTTGGTGTA‑3’CYP2C8‑1R 5’‑TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC‑3’CYP2C8‑2F 5’‑CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA‑3’CYP2C8‑2R 5’‑GACCTTTTATTCCTACACCCTATG‑3’CYP2C8‑3F 5’‑TGTCTGGCTGGACCTGAGTT‑3’CYP2C8‑3R 5’‑GGTGGAGCACATGGGTGTTA‑3’所述测序引物的核苷酸序列包括：CYP2C8‑1F 5’‑TTCAATCAGGGCTTGGTGTA‑3’CYP2C8‑1R 5’‑TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC‑3’CYP2C8‑2F 5’‑CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA‑3’CYP2C8‑2R 5’‑GACCTTTTATTCCTACACCCTATG‑3’CYP2C8‑3F 5’‑TGTCTGGCTGGACCTGAGTT‑3’CYP2C8‑3R 5’‑GGTGGAGCACATGGGTGTTA‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种以DNA为模板使用Sanger测序法检测CYP2C8基因多态性位点的引物，其特征在于，包括有：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’所述测序引物的核苷酸序列包括：CYP2C8-1F5’-TTCAATCAGGGCTTGGTGTA-3’CYP2C8-1R5’-TATTTCAAGAAGAGGGTCTATGC-3’CYP2C8-2F5’-CACTTTCTTCCTTGGCTGTGA-3’CYP2C8-2R5’-GACCTTTTATTCCTACACCCTATG-3’CYP2C8-3F5’-TGTCTGGCTGGACCTGAGTT-3’CYP2C8-3R5’-GGTGGAGCACATGGGTGTTA-3’。2.根据权利要求1所述的检测CYP2C8基因多态性位点的引物，其特征在于，引物序列CYP2C8-1F/CYP2C8-1R是扩增CYP2C8*2多态性位点的引物，引物序列CYP2C8-2F/CYP2C8-2R和CYP2C8-3F/CYP2C8-3R是扩增CYP2C8*3多态性位点的引物。3.根据权利要求1所述的检测CYP2C8基因多态性位点的引物，其特征在于，引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑志高，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33