一种血小板膜蛋白CD36抗原基因分型的PCR-SBT方法及试剂技术

本发明专利技术提供一种CD36抗原分型的PCR‑SBT方法，它包括以下步骤制备人基因组DNA；提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增CD36抗原的基因序列；将扩增产物进行双酶切纯化；提供测序引物，将纯化产物进行测序PCR反应；将测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；将获得的序列通过软件分析，确定其基因型。本发明专利技术还提供上述方法所用的试剂。本发明专利技术通过对CD36抗原5`端及1‑15外显子的基因序列分别进行序列测序，获得CD36抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。本发明专利技术对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种血小板膜蛋白CD36抗原基因分型的PCR-SBT方法及试剂
本专利技术涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人类血小板膜蛋白CD36缺失型突变基因的分子生物学检测方法,本专利技术还涉及该方法所应用的试剂。
技术介绍
近年来,由于输血技术的发展,临床上机采血小板输注己经成为治疗血小板减少的重要手段之一。然而随着输注次数的增加，一些慢性、长期输注的病人出现了血小板输注无效的现象。故血小板输注无效成为临床上非常棘手的问题，引起了输界的广泛关注。血小板输注无效的原因分为非免疫因素和免疫因素,近年来,免疫因素中的CD36抗原缺失所引起的输注后并发症成为研究热点。针对这一情况我们研发测序试剂盒检测CD36抗原缺失的基因突变点,并推测了CD36抗原缺失和血小板输注无效之间的关系。期望CD36抗原的检测能成为输血实验室的常规检测项目，从而减少血小板输注后并发症的发生。人CD36基因全长32Kb，位于染色体7q.2,含有15个外显子。外显子1，2和15是非编码区，其余12个外显子参与编码氨基酸,外显子3和14编码CD36蛋白分子的N和C末端。在CD36基因上存在独立的第一外显子和3个独立的启动子，没有TATA盒序列和CpG岛。对CD36基因突变的研究已有大量文献报道。目前已检测到20多个CD36突变基因，导致产生CD36抗原缺失型。基因突变机制包括单核苷酸取代、碱基缺失、碱基插入以及mRNA剪接加工中的外显子跳读作用，使转化产生的成熟mRNA缺失1个或数个外显子。基因突变可以产生两种类型的CD36抗原缺失。1型CD36缺失个体的血小板和单核细胞表面都不表达CD36抗原;2型缺失个体只是血小板不表达CD36抗原。II型比I型更常见。血小板CD36缺失在白种人中非常罕见(0.3%)，而在亚洲人群(3-10%)和非洲人群中(7%)频率很高。最近有报道对德国人种献血者进行CD36(-)血小板蹄选，到目前为止还未发现阴性标本。在非洲人群和非洲美国人种中与CD36缺失有关的发现的基因突变和亚洲人群的明显不同。CD36基因具有高度多态性。对非洲西部拒疾病发区个体CD36基因进行研究发现了24个突变体。血小板CD36上的抗原表位被称作Naka，其相应的抗体命名为抗-Naka抗体。抗-Naka首次在多次接受HLA同型血小板输注后发生血小板输注无效(PTR)的病人体内鉴别出来。后来大量案例报道抗-Naka抗体与输血反应密切相关。抗-Naka抗体还可引起免疫性血小板减少症、早期胎儿死亡(repeatearlyfetalloss)等疾病。F.Nakajima等(2008)在最近的研究中证明了抗-Naka在输血相关急性肺损伤(TRALI)的发生发展过程中发挥关键作用。目前国内对CD36的研究多集中于其与脂代谢和糖代谢性疾病的关联,缺乏对CD36整个基因多态性的系统研究以及输血安全相关研究。比起血小板其他糖蛋白缺失,CD36缺失具有频率较高的特性，且CD36缺乏个体通常不表现症状,这无疑增加了CD36缺失患者的输血不良反应的发生。迄今为止,己发现CD36基因变异与代谢综合征，乳糖不耐症，胰岛素抵抗，心肌梗死，动脉粥样硬化,冠心病，糖尿病，高血压，高血脂，血管新生，血栓性疾病，中风，阿尔茨海默病，拒疾等多种疾病相关。针对血小板CD36缺失可能导致的输血风险，目前CD36鉴定方法主要有血清学方法和基因分型方法。血清学鉴定粒细胞抗原或抗体方法主要有粒细胞凝集试验、粒细胞免疫荧光试验(GIFT)、单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕获试验(MonoclonalAntibodyImmobilizationOfGranulocyteAntigen,MAIGA)、流式细胞术和ELISA等方法。粒细胞抗原系统的基因分型方法主要有PCR-RFLP,PCR-SSP,PCR-SSO等。Bux等的实验表明，基因分型法与MAIGA方法对CD36的分型具有同样的可靠性，而GIFT有15%的分型失误率。目前的CD36抗原基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)，该方法需要进行多管扩增，并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的CD36抗原进行基因分型，对于一些特殊的新突变位点则难以明确。而CD36的PCR-SBT(PCR-SequenceBasedTyping,基于PCR测序的分型技术)分型方法可以克服上述缺陷和局限性，为最准确的分型的方法。但现阶段的CD36抗原基因PCR-SBT分型方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对CD36抗原进行基因分型，但至今未对CD36基因同一PCR条件及干燥PCR引物在PCR板上进行系统测序。因此，建立一种人类血小板膜蛋白CD36缺失型突变基因的PCR-SBT方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种人类血小板膜蛋白CD36缺失型突变基因的PCR-SBT方法，以克服现有基因分型技术中的上述缺陷。为此，本专利技术采用以下技术方案它对CD36抗原5`端及1-15外显子的基因序列分别进行序列测序基因进行分型，包括以下步骤：(1)提供扩增引物，使用离心干燥机把引物干燥置于可拆分96孔PCR板底部，封膜后保存于-20℃备用；(2)制备人基因组DNA；(3)用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中CD36基因的5`端及1-15外显子的基因序列；(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(5)提供测序引物，将步骤(4)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(6将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序;(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。所述步骤(4)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。本专利技术另一个所要解决的技术问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本专利技术采用以下技术方案它由用于扩增的引物和用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；所述用于扩增的引物为：CD36-5'-FTGTAAAACGACGGCCAGTAAAATAAGTTTCGCAAGCTCACD36-5'-RCAGGAAACAGCTATGACCTCCCCCACACAGCACATTACTGCD36-EXON1-FTGTAAAACGACGGCCAGTGCTGAATATCTCAGATATAGGCD36-EXON1-RCAGGAAACAGCTATGACCGTATTTATACAGTAGTGTCACCCD36-EXON2-FTGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTAGTCTATCCAAAGTCCD36-EXON2-RCAGGAAACAGCTATGACCGTATGGTAACAGATGTTTTATTCD36-EXON3-FTGTAAAACGACGGCCAGTGTAGGCATTAGAAGCAAGAACD36-EXON3-RCAGGAAACAGCTATGACCAGTCGCATCATATAGAGTTGCD36-EXON4-FTGTAAAACGACGGCCAGTAAAGCGTCACTCTAAAGCCD36-EXON4-RCAGGAAACAGCTATGACCATGACATTTGCCAAGTAGAAGCD36-EXON5-FTGTAAAACGACGGCCAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血小板膜蛋白CD36抗原基因分型的PCR‑SBT方法及试剂，其特征在于它由用于扩增的引物和用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成； 所述用于扩增的引物为 CD36抗原基因序列的扩增引物，其方法包括以下步骤 ：(1)提供扩增引物，使用离心干燥机把引物干燥置于可拆分96孔PCR板底部，封膜后保存于‑20℃备用；(2)制备人基因组DNA ；(3)用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中CD36抗原5`端及1‑15外显子的基因序列；(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(5)提供测序引物，将步骤(4)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。

【技术特征摘要】
1.一种血小板膜蛋白CD36抗原基因分型的PCR-SBT方法及试剂，其特征在于它由用于扩增的引物和用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；所述用于扩增的引物为CD36抗原基因序列的扩增引物，其方法包括以下步骤：(1)提供扩增引物，使用离心干燥机把引物干燥置于可拆分96孔PCR板底部，封膜后保存于-20℃备用；(2)制备人基因组DNA；(3)用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中CD36抗原5`端及1-15外显子的基因序列；(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(5)提供测序引物，将步骤(4)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。2.根据权利要求I所述的一种血小板膜蛋白CD36抗原基因分型的PCR-SBT方法及试剂，其特征在于所述步骤(2)中的扩增引物为16对寡核苷酸分别扩增CD36抗原5`端及1-15外显子的基因序列的基因序列CD36抗原系统的基因序列的扩增引物CD36-5’-FTGTAAAACGACGGCCAGTAAAATAAGTTTCGCAAGCTCACD36-5’-RCAGGAAACAGCTATGACCTCCCCCACACAGCACATTACTGCD36-EXON1-FTGTAAAACGACGGCCAGTGCTGAATATCTCAGATATAGGCD36-EXON1-RCAGGAAACAGCTATGACCGTATTTATACAGTAGTGTCACCCD36-EXON2-FTGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTAGTCTATCCAAAGTCCD36-EXON2-RCAGGAAACAGCTATGACCGTATGGTAACAGATGTTTTATTCD36-EXON3-FTGTAAAACGACGGCCAGTGTAGGCATTAGAAGCAAGAACD36-EXON3-RCAGGAAACAGCTATGACCAGTCGCATCATATAGAGTTGCD36-EXON4-FTGTAAAACGACGGCCAGTAAAGCGTCACTCTAAAGCCD36-EXON4-RCAGGAAACAGCTATGACCATGACATTTGCCAAGTAGAAGCD36-EXON5-FTGTAAAACGACGGCCAGTCTATCTGGCATATTCTGTGTCD36-EXON5-RCAGGAAACAGCTATGACCAAGCATCTTCCTGTAATCTGCD36-EXON6-FTGTAAAACGACGGCCAGTGGAATGTCGTCTTCTTGTGCD36-EXON6-RCAGGAAACAGCTATGACCAATTATGCCTTGCCAATGCCD36-EXON7-FTGTAAAACGACGGCCAGTCCTCACCTCAACATAGTAAGACD36-EXON7-RCAGGAAACAGCTATGACCGAGTTAATACCTAGCAGAACAGCD36-EXON8-FTGTAAAACGACGGCCAGTTGATCTGGCTACCTAATGGCCD36-EXON8-RCAGGAAACAGCTATGACCCTCTGAATCATGCAGTAAGGGCD36-EXON9-FTGTAAAACGACGGCCAGTATGGACTACACTGGAGGAGCD36-EXON9-RCAGGAAACAGCTATGACCTTGGAAGATGCAGAAGAACACD36-EXON10-FTGTAAAACGACGGCCAGTTTCATGCTTGGCTATTGAGTTCD36-EXON10-RCAGGAAACAGCTATGACCTCTTTCTTCTGCCCTAATCD36-EXON11-FTGTAAAACGACGGCCAGTGCCTGAAAGCTTTACATATTGCD36-EXON11-RCAGGAAACAGCTATGACCCCATAGGAAGAAATCGACCCD36-EXON12-FTGTAAAACGACGGCCAGTAACCTTGACATTCGATTGGCD36-EXON12-RCAGGAAACAGCTATGACCGAGATGCTATCAAATGCTCACD36-EXON13-FTGTAAAACGACGGCCAGTTATTTCAGTTCCCCGAGACD36-EXON13-RCAGGAAACAGCTATGACCTTTGTTCAATTGGATCATCD36-EXON14-FTGTAAAACGACGGCCAGTCTGATGACTAACACCAATAGAGCD36-EXON14-RCAGGAAACAGCTATGACCTGGACAACTTTGGCACAACD36-EXON15-FTGTAAAACGACGGCCAGTCATCATTTCCACAACTGCD36-EXON15-RCAGGAAACAGCTATGACCATTAGCCTAGAACAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁浩强，付涌水，叶欣，
申请(专利权)人：广州血液中心，
类型：发明
国别省市：广东,44